馬皰疹病毒1型ORF30基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
關(guān)鍵詞：orf30基因 原核表達(dá) 載體
摘要：馬皰疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕馬流產(chǎn)的主要病原體之一,也與死胎、新生幼駒死亡、青年馬鼻肺炎以及一種名為馬皰疹病毒性腦脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)。近些年來(lái),EHM出現(xiàn)的頻率越來(lái)越高,對(duì)養(yǎng)馬業(yè)和賽馬業(yè)的危害很大。最新研究結(jié)果顯示,神經(jīng)致病性毒株與編碼病毒DNA聚合酶催化亞基的ORF30基因單核苷酸點(diǎn)突變有著很高的相關(guān)性。為了獲得馬皰疹病毒1型DNA聚合酶,并制備DNA聚合酶的多克隆抗體,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因組DNA為模板,擴(kuò)增ORF30基因編碼區(qū),并連接于pMD19-T載體上,用BamHI和HindIII雙酶切后,將酶切產(chǎn)物插入表達(dá)pET-28a(+)中,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞,構(gòu)建ORF30基因的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-ORF30。通過(guò)酶切、PCR擴(kuò)增和測(cè)序等方法對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明,構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-ORF30經(jīng)BamhⅠ和HindⅢ雙酶切后,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳結(jié)果與預(yù)期相符,表明目的片段成功插入載體pET28a(+)中。通過(guò)采用特異性引物對(duì)重組質(zhì)粒pET28a(+)-ORF30進(jìn)行PCR鑒定,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察,得到一條大小約1074bp的清晰條帶,與目的基因大小相符,表明重組質(zhì)粒pET28a(+)-ORF30構(gòu)建成功。本研究為進(jìn)一步探討馬皰疹病毒1型ORF30基因遺傳變異對(duì)DNA聚合酶功能的影響奠定了基礎(chǔ)。
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