導(dǎo)言：作為寫作愛(ài)好者，不可錯(cuò)過(guò)為您精心挑選的10篇白貓計(jì)劃，它們將為您的寫作提供全新的視角，我們衷心期待您的閱讀，并希望這些內(nèi)容能為您提供靈感和參考。

篇1

“志強(qiáng)，我們公司正缺設(shè)計(jì)人員，回來(lái)和我們一起干吧！”2003年，就在肖志強(qiáng)從美院畢業(yè)后，遠(yuǎn)在長(zhǎng)沙創(chuàng)辦廣告公司的姐姐、姐夫讓他回去幫忙。盡管留在北京對(duì)他有很大的誘惑，但再怎么也是給別人打工，而回長(zhǎng)沙就是自己的事業(yè)了，更何況姐姐、姐夫還許諾給他20%的股份。所以，肖志強(qiáng)義無(wú)反顧地選擇了回長(zhǎng)沙！

幾年前，姐姐和姐夫創(chuàng)辦了“百色”廣告公司，主要設(shè)計(jì)和平面媒體廣告，在當(dāng)?shù)匦∮忻麣狻６ぶ緩?qiáng)的加盟更是如虎添翼，三人分工明確，姐夫執(zhí)掌公司運(yùn)營(yíng)，姐姐負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)，肖志強(qiáng)則負(fù)責(zé)廣告設(shè)計(jì)和制作。三人配合密切，不但令公司成員過(guò)著富足的生活，而且公司的名氣節(jié)節(jié)上升。

2004年春節(jié)剛過(guò)，姐姐和姐夫就告訴他：他們移民澳洲的申請(qǐng)獲得批準(zhǔn)，決定長(zhǎng)期在澳洲居住，準(zhǔn)備將百色廣告公司交給肖志強(qiáng)一人打理。

獨(dú)掌偌大一個(gè)公司，肖志強(qiáng)心中有些忐忑，但更多的是豪情萬(wàn)丈：自己是設(shè)計(jì)部經(jīng)理，不但在技術(shù)方面得心應(yīng)手、游刃有余，而且作為公司的合伙人，對(duì)公司的狀況也了如指掌。自己接管公司，雖然不能在短期內(nèi)突飛猛進(jìn)，但至少可以讓良好的業(yè)績(jī)持續(xù)下去。

然而，令肖志強(qiáng)始料不及的是，上任伊始便出師不利。

姐姐、姐夫離開后，管理、業(yè)務(wù)、設(shè)計(jì)全都由他一手抓，使原本一門心思專注于廣告創(chuàng)意、制作的肖志強(qiáng)，一時(shí)間手忙腳亂。

業(yè)務(wù)部與設(shè)計(jì)部的矛盾也在悄悄滋生。2004年初，長(zhǎng)沙國(guó)際名車展開展。憑著公司原有的知名度，業(yè)務(wù)人員力挫眾多對(duì)手，取得了幾家汽車廠家的廣告權(quán)，但要求嚴(yán)格：必須在兩天內(nèi)提供廣告設(shè)計(jì)樣稿。可肖志強(qiáng)忙于公司管理，根本無(wú)暇再管理廣告設(shè)計(jì)。結(jié)果，竟有一份在幾次修改后，還是達(dá)不到客戶要求而告吹。煮熟的鴨子，飛了！這一次，業(yè)務(wù)人員終于忍不住發(fā)難了，指責(zé)設(shè)計(jì)部全是靠他們養(yǎng)活，都是白拿工資的廢物。

盡管以往也有設(shè)計(jì)部埋怨業(yè)務(wù)部反反復(fù)復(fù)、朝令夕改，業(yè)務(wù)部怪罪設(shè)計(jì)部拖拖拉拉、延誤工期的事情發(fā)生，但當(dāng)時(shí)兩個(gè)部門分別由姐姐和自己掌管，底下員工偶有沖突，也不過(guò)是發(fā)發(fā)牢騷而已?？涩F(xiàn)在姐姐、姐夫的離開，使兩個(gè)部門同時(shí)缺失了密切配合的主管，部門間的矛盾便漸漸由小變大、由暗地的互相埋怨轉(zhuǎn)向公開的相互指責(zé)。

設(shè)計(jì)部為滿足客戶的要求筋疲力盡，業(yè)務(wù)部為著履行工期左右為難！

自從他加入公司后，就一直在設(shè)計(jì)部任職，朝夕相處，使他不自覺(jué)地偏袒設(shè)計(jì)部。潛意識(shí)的情感傾斜，很快就造成了重大損失，業(yè)務(wù)部的員工漸漸開始消極怠工。

離心容易重建難

發(fā)展受阻慘敗收?qǐng)?/p>

結(jié)果，公司業(yè)績(jī)一落千丈，不但開發(fā)新客戶受阻，就連老客戶都似乎有慢慢流失的趨勢(shì)。這時(shí)，肖志強(qiáng)才警覺(jué)到自己偏聽偏信的后果。他想維護(hù)業(yè)務(wù)人員時(shí)，又使設(shè)計(jì)部陷入了備受冷落的狀態(tài)。短短兩個(gè)月，公司的消極情緒四處蔓延。

每天，肖志強(qiáng)不僅要負(fù)責(zé)業(yè)務(wù)，還要協(xié)調(diào)好兩部門間的關(guān)系，他越來(lái)越覺(jué)得力不從心。無(wú)奈之下，他炒掉了幾個(gè)業(yè)績(jī)不好、總用理由搪塞的業(yè)務(wù)人員，也將設(shè)計(jì)部里幾個(gè)恃才傲物的員工一并“忍痛割愛(ài)”了。

這樣，兩部門總可以和平相處了吧？然而，接下來(lái)的招聘工作，令肖志強(qiáng)幾乎氣餒。設(shè)計(jì)部倒還好說(shuō)，畢竟他知道需要配置什么樣的設(shè)計(jì)人員，而業(yè)務(wù)部的招聘工作卻遠(yuǎn)沒(méi)有這么順利。開始招進(jìn)來(lái)的一些業(yè)務(wù)人員，雖然工作積極，可惜業(yè)績(jī)太差，大多數(shù)新進(jìn)人員在試用期內(nèi)顆粒無(wú)收，公司只是白白支付了兩個(gè)月的薪水。

為了扭轉(zhuǎn)局面，肖志強(qiáng)決定降低新進(jìn)人員的薪水，增加招聘名額，以期全面撒網(wǎng)，重點(diǎn)培養(yǎng)。于是，公司由原來(lái)的18人暴增到28人?？雌饋?lái)公司又恢復(fù)了以前熙熙攘攘、欣欣向榮的光景，但是問(wèn)題也接踵而至。

由于新員工的數(shù)量很大，直接管理就變得很困難，人員管理逐漸失去了控制。新老員工又存在著明顯的隔閡，公司內(nèi)部逐漸形成了一個(gè)個(gè)的小團(tuán)體。同時(shí)，由于薪酬水平的降低，招聘的業(yè)務(wù)人員素質(zhì)也隨之降低，個(gè)別業(yè)務(wù)人員根本無(wú)法根據(jù)客戶意圖為客戶設(shè)計(jì)可行性方案。眾多意向性客戶分布于各行各業(yè)，有些鑒于“百色”的知名度，勉強(qiáng)同意合作，但一段時(shí)間后，客戶常常因收不到廣告效果而終止合同。老客戶也因新客戶的良莠不齊對(duì)公司失去原有的信賴，漸漸疏于聯(lián)絡(luò)。

公司與一家報(bào)社的合同馬上就到期了，報(bào)社欲對(duì)該欄目重新招商，要公司盡快拿出一套新的方案來(lái)。那天，肖志強(qiáng)特意主持了員工大會(huì)，希望大家獻(xiàn)計(jì)獻(xiàn)策。然而，令他吃驚的是，曾經(jīng)可以為一項(xiàng)工作爭(zhēng)論得面紅耳赤的同事們，如今個(gè)個(gè)相敬如賓，一切唯他馬首是瞻，沒(méi)有疑義，也沒(méi)有建議。結(jié)果一場(chǎng)討論會(huì)竟變成了一場(chǎng)氣氛沉悶的個(gè)人發(fā)言。

篇2

【關(guān)鍵詞】 孕中期; 甲胎蛋白; 游離β人絨毛膜促性腺激素; 臍動(dòng)脈血流; 多普勒; 不良妊娠結(jié)局

Abstract： 【Objective】 To investigate the clinical value of second trimester maternal serum screening and umbilical artery Doppler for prediction of adverse pregnancy outcome. 【Method】 A total of 876 women were taken blood sample during 14 to 21 weeks for the measurement of alpha fetoprotein and free β human chorionic gonadotropin with time-resolved fluorescence assay. Among them， 536 cases were measured the umbilical artery index with color ultrasound Doppler during 14 to 28 weeks. In the end， the pregnancy outcome was record and analyzed. We compared the difference of incidence of adverse outcome between the group of high levels of maternal serum markers (342 cases)， the group of abnormal umbilical artery index (82 cases)， and the group of both maternal serum markers and umbilical artery index were abnormal (40 cases). 【Result】 The high levels of maternal serum markers was significantly associated with preeclampsia， neonatal asphyxia， fetal growth restriction， fetal demise， and abnormal placenta. The incidence of associated adverse outcome was 12.65% in the group of high levels of maternal serum markers， 8.5% in the group of abnormal umbilical artery index， and 30.95% in the group that both maternal serum markers and umbilical artery index were abnormal. The adverse outcome incidence of the last group was significant higher than the former two. 【Conclusion】 High levels of maternal serum markers combine with abnormal umbilical index are associated with higher adverse outcome incidence.

唐氏綜合征(Down?蒺s Syndrome，DS)是活產(chǎn)新生兒最常見(jiàn)的染色體疾病，其血清學(xué)產(chǎn)前篩查正在普及。目前我國(guó)大部分地區(qū)采用孕中期母體血清標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)、游離β人絨毛促性腺激素(free β human chorionic gonadotropin，free-β-hCG，以下簡(jiǎn)稱hCG)二聯(lián)生化指標(biāo)篩查，以評(píng)估胎兒可能患唐氏綜合征、18-三體綜合征、神經(jīng)管缺陷等疾病的風(fēng)險(xiǎn)率。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明，當(dāng)不存在染色體異常及胎兒畸形時(shí)，母體血清標(biāo)志物水平的異常升高與不良妊娠結(jié)局有著密切的關(guān)系[1-3]，于是孕早、中期母血清標(biāo)志物對(duì)于不良妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)意義逐漸成為研究的熱點(diǎn)。但由于僅僅使用血清標(biāo)志物進(jìn)行不良妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)存在特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不高的缺陷，對(duì)臨床的指導(dǎo)意義有限?，F(xiàn)階段研究的重點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)移至開發(fā)新的標(biāo)志物，即與血清標(biāo)志物聯(lián)合使用時(shí)，能提高預(yù)測(cè)的效果，提高臨床應(yīng)用的價(jià)值。臍動(dòng)脈血流與胎兒、胎盤血液循環(huán)密切相關(guān)，它反應(yīng)了胎兒血液灌注情況。國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道臍動(dòng)脈血流頻譜異常的圍產(chǎn)兒其胎兒窘迫發(fā)生率、新生兒窒息率、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩率及圍產(chǎn)兒死亡率均明顯高于血流正常者[4-6]。母親方面如子癇前期[7]、糖尿病等導(dǎo)致胎盤缺血、缺氧的疾病可以導(dǎo)致臍動(dòng)脈血流頻譜比值增高[8]。因此，通過(guò)對(duì)臍血流圖分析，從而了解胎兒、胎盤循環(huán)阻力情況，對(duì)高危妊娠的監(jiān)測(cè)及胎兒結(jié)局預(yù)后有重要的臨床價(jià)值。臍動(dòng)脈血流是否能作為與血清標(biāo)志物聯(lián)合用于評(píng)估母兒結(jié)局的指標(biāo)，尚待進(jìn)一步研究。而目前將血清標(biāo)志物聯(lián)合臍動(dòng)脈血流用于監(jiān)測(cè)胎兒結(jié)局的研究尚處于空白階段。本文旨在探討孕中期血清標(biāo)志物(AFP、hCG)及臍動(dòng)脈血流與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系，評(píng)價(jià)二者聯(lián)合用于預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局的可能性及意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2006 年1月至2009年4月期間在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院進(jìn)行如下檢查的孕婦：妊娠14 ～ 21周血清學(xué)篩查(共876例);其中在妊娠14 ～ 28周彩超下行臍動(dòng)脈血流監(jiān)測(cè)(共536例)，并有分娩結(jié)局者。納入標(biāo)準(zhǔn)：分娩的胎兒無(wú)染色體或結(jié)構(gòu)異常者;單胎妊娠;漢族;排除行產(chǎn)前篩查時(shí)已患有本次研究中的產(chǎn)科并發(fā)癥或病理妊娠的孕婦;排除IVF的孕婦;排除與AFP升高有關(guān)的疾病，如部分卵巢腫瘤、肝癌等。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

主要觀察的妊娠結(jié)局(及妊娠并發(fā)癥)包括：子癇前期;胎兒生長(zhǎng)受限;低出生體重兒;新生兒窒息;胎兒丟失;胎盤異常：包括前置胎盤、胎盤早剝、胎盤植入;早產(chǎn);羊水過(guò)少;產(chǎn)后出血;妊娠合并貧血;妊娠期糖尿病;胎膜早破;臍帶繞頸;內(nèi)科合并癥：包括肝功能異常、自身免疫疾病、妊娠合并性傳播疾病等。以上妊娠結(jié)局(及妊娠并發(fā)癥)的診斷參照樂(lè)杰主編的《婦產(chǎn)科學(xué)》第6版的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 方法及試劑

1.3.1 試劑及儀器

接受篩查者在孕14 ～ 21周期間，抽取靜脈血2 mL。待自然凝固后分離血清，標(biāo)本保存于-20 ℃冰箱，于1周內(nèi)收集并由專人檢測(cè)。篩查的血清標(biāo)志物為AFP和Free-β-hCG。血清學(xué)分析測(cè)定使用廣州市豐華生物工程有限公司生產(chǎn)的AFP和Free-β-hCG試劑盒，檢測(cè)儀器采用泰萊Ⅱ型時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)，測(cè)定按操作程序嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)控，測(cè)定批內(nèi)變異系數(shù)，不同批次試劑不混用，異常結(jié)果重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。運(yùn)用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估軟件計(jì)算上述兩種標(biāo)志物的中位數(shù)倍數(shù)(MoM)值，凡AFP≥2.0 MoM和/或hCG≥2.0 MoM的孕婦為血清學(xué)標(biāo)志物升高者。采用珠海艾博羅生物技術(shù)有限公司提供的產(chǎn)前篩查軟件系統(tǒng)。

應(yīng)用PHILIPS公司彩色多普勒超聲診斷儀常規(guī)檢查胎兒，探頭頻率3.5 mHz。選擇臍動(dòng)脈近胎盤處進(jìn)行多普勒檢測(cè)，取樣容積2.4 ～ 3.6 mm，角度 < 60°，連續(xù)出現(xiàn)3個(gè)以上相同波形時(shí)，測(cè)量S/D、RI、PI數(shù)值并記錄(圖1、2)。臍動(dòng)脈血流的S/D、RI、PI正常值范圍參照參考文獻(xiàn)[9]。

1.3.2 研究方法

篩選不良妊娠結(jié)局：血清學(xué)標(biāo)志物升高者包括單項(xiàng)血清hCG≥2.0 MoM、單項(xiàng)血清AFP≥2.0 MoM及兩項(xiàng)血清標(biāo)志物水平均升高，分析它們與血清學(xué)標(biāo)志物正常者(hCG及AFP均 < 2.0 MoM)的上述妊娠結(jié)局(妊娠并發(fā)癥)的發(fā)生率的差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的妊娠結(jié)局為與血清標(biāo)志物升高有關(guān)的不良妊娠結(jié)局。比較血清標(biāo)志物升高者、臍動(dòng)脈血流異常者及兩者同時(shí)異常者之間相關(guān)不良妊娠結(jié)局發(fā)生率的差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均輸入EXCEL表格，采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組數(shù)據(jù)所得結(jié)果中，計(jì)量資料用x ± s表示，計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用四格表?字2檢驗(yàn)、連續(xù)校正?字2檢驗(yàn)及Fisher?蒺s精確概率法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P < 0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 研究人群的一般狀況分析

總例數(shù)876例，其中血清學(xué)標(biāo)志物升高者(以下簡(jiǎn)稱升高組) 382例，血清學(xué)標(biāo)志物正常者(以下簡(jiǎn)稱正常組) 494例。升高組平均年齡(29.56 ± 3.72)歲，正常組(29.53 ± 3.50)歲，兩者比較P = 0.880 > 0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;升高組平均體重(54.39 ± 9.22) kg，正常組(54.73 ± 6.97) kg，兩者比較P = 0.537 > 0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;升高組平均篩查孕周(17.82 ± 1.83)歲，正常組(17.90 ± 1.85)歲，兩者比較P = 0.502 > 0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。升高組中hCG≥2.0 MoM者285例，AFP≥2.0 MoM者76例，hCG及AFP均≥2.0 MoM者21例。

2.2 相關(guān)不良妊娠結(jié)局的篩選

比較血清標(biāo)志物水平升高者(382例)與正常者(494例)之間不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率。將血清標(biāo)志物水平升高者中進(jìn)行分組，分為hCG≥2.0 MoM，hCG≥3.0 MoM，AFP≥2.0 MoM，hCG和AFP同時(shí)≥2.0 MoM 4個(gè)組。比較4個(gè)組與血清標(biāo)志物正常者之間各種不良妊娠結(jié)局及并發(fā)癥的發(fā)生率。當(dāng)hCG≥2.0 MoM時(shí)，子癇前期、新生兒窒息的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)hCG≥3.0 MoM時(shí)，胎兒生長(zhǎng)受限及子癇前期的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)AFP≥2.0 MoM時(shí)，子癇前期的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)hCG和AFP同時(shí)≥2.0 MoM時(shí)，胎兒丟失、胎盤異常的發(fā)生率與正常者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而其他9種不良妊娠結(jié)局或妊娠并發(fā)癥的發(fā)生率在血清標(biāo)志物升高者與正常者之間無(wú)明顯差別。因此，與血清標(biāo)志物升高有關(guān)的不良妊娠結(jié)局應(yīng)包括子癇前期、新生兒窒息、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒丟失及胎盤異常。

2.3 血清學(xué)標(biāo)志物水平與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系

比較血清學(xué)標(biāo)志物水平升高組與正常組之間的上述篩選出的不良妊娠結(jié)局(即子癇前期、新生兒窒息、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒丟失及胎盤異常)發(fā)生率的差異。血清學(xué)標(biāo)志物水平升高者，即AFP≥2.0 MoM和/或hCG≥2.0 MoM者，共382例，其中發(fā)生相關(guān)不良妊娠結(jié)局者有56例，發(fā)生率14.67%;同期檢測(cè)的血清學(xué)標(biāo)志物水平正常者，即AFP和hCG均 < 2.0 MoM，共494例，其中發(fā)生相關(guān)不良妊娠結(jié)局者有25例，發(fā)生率5.06%。兩組發(fā)生率之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值為0.000，OR值3.223，95%置信區(qū)間(1.970-5.272)。

2.4 臍動(dòng)脈血流異常與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系

在876例孕婦中，共進(jìn)行536例臍動(dòng)脈血流監(jiān)測(cè)。臍動(dòng)脈血流異常組，即PI、RI、S/D三項(xiàng)中一項(xiàng)或幾項(xiàng)異常者，共123例，其中發(fā)生上述相關(guān)不良妊娠結(jié)局者有20例，發(fā)生率16.26%;臍動(dòng)脈血流正常組，即PI、RI、S/D三項(xiàng)均正常者，共413例，其中發(fā)生上述相關(guān)不良妊娠結(jié)局者有18例，發(fā)生率4.36%。兩組之間不良妊娠結(jié)局發(fā)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值為0.000，OR值4.261，95%置信區(qū)間(2.175 ～ 8.350)。

2.5 兩指標(biāo)單項(xiàng)與二者同時(shí)異常與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系

進(jìn)一步比較血清學(xué)標(biāo)志物或臍動(dòng)脈血流單項(xiàng)異常，與兩者同時(shí)異常之間不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率，分別為43/340(12.65%)、7/82(8.5%)和13/42(30.95%)，可以發(fā)現(xiàn)，單純血清學(xué)標(biāo)志物升高或單純臍動(dòng)脈血流異常與兩者同時(shí)異常者3組之間不良妊娠結(jié)局發(fā)生率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值為0.007。兩兩比較，單純血清學(xué)標(biāo)志物升高與單純臍動(dòng)脈血流異常的不良妊娠結(jié)局發(fā)生率的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值為0.301;而血清學(xué)標(biāo)志物升高組、臍動(dòng)脈血流異常組與兩者同時(shí)異常組不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值為0.002、0.001。

3 討 論

近年來(lái)，一些學(xué)者觀察到hCG水平顯著增高的孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的幾率明顯高于hCG水平正常的孕婦。Ong等[10]測(cè)定5584例妊娠10 ～ 14周的母血hCG，然后隨訪妊娠結(jié)局，認(rèn)為異常hCG水平與不良妊娠結(jié)局的發(fā)展有關(guān)。hCG水平的變化作為監(jiān)測(cè)妊娠中母兒危險(xiǎn)性的指標(biāo)，其可能的病理生理基礎(chǔ)為某些病理因素導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞低氧環(huán)境，從而使滋養(yǎng)細(xì)胞大量地反應(yīng)性增生，hCG產(chǎn)生增加，并分泌入血，使母血清中hCG水平升高。

血清AFP值可預(yù)測(cè)胎血甲胎蛋白值以及胎-母屏障的完整性和通透性。Alkazaleh等學(xué)者[11]對(duì)孕中期AFP的升高對(duì)不良妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)(包括FGR、早產(chǎn)、子癇前期、胎盤早剝)進(jìn)行研究，認(rèn)為可能是胎盤缺血-血栓形成而導(dǎo)致胎盤屏障的破壞，使得AFP由胎兒向母體循環(huán)輸送增多的結(jié)果。而胎盤缺血-血栓形成可導(dǎo)致胎盤功能不全。Gkogkos 等[12]所做的前瞻性研究表明，中孕期母血AFP≥2.0 MoM時(shí)，聯(lián)合其他胎盤功能檢測(cè)項(xiàng)目，可有效檢出嚴(yán)重胎盤功能不全及相關(guān)不良妊娠結(jié)局。

當(dāng)臍動(dòng)脈血流出現(xiàn)異常，反映了胎兒、胎盤循環(huán)量不足[13]。劉智等[14]研究表明，當(dāng)胎盤小葉被結(jié)扎60%時(shí)，臍動(dòng)靜脈血流均有改變，因此，臍動(dòng)脈血流反映了胎盤小葉的循環(huán)情況，如出現(xiàn)胎盤病理狀態(tài)，如胎盤水腫、缺血、梗死等，達(dá)到一定的嚴(yán)重程度時(shí)，臍動(dòng)脈血流將會(huì)出現(xiàn)異常改變。

本研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒丟失、新生兒窒息及胎盤異常的發(fā)生率在血清標(biāo)志物升高組與正常組之間的發(fā)生率是存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的，而上述不良妊娠結(jié)局與胎盤功能不全有密切關(guān)系，因此，其病理生理基礎(chǔ)可能為胎盤功能不全引起母血中血清標(biāo)志物水平升高，而胎盤功能不全最終導(dǎo)致了上述不良妊娠結(jié)局。

將血清標(biāo)志物升高用于預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局，當(dāng)兩個(gè)標(biāo)志物同時(shí)升高時(shí)，其預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局的OR值最高(51.895)，相關(guān)的不良妊娠結(jié)局為胎兒丟失。而單個(gè)標(biāo)志物升高預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局的OR值則較低。因此，當(dāng)有兩個(gè)標(biāo)志物同時(shí)升高時(shí)，我們首先應(yīng)關(guān)注胎兒丟失的風(fēng)險(xiǎn)，其次為胎盤異常。

我們發(fā)現(xiàn)在比較不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率時(shí)，使用單一指標(biāo)血清標(biāo)志物水平升高及臍動(dòng)脈血流異常與兩者聯(lián)合相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而將三者進(jìn)行兩兩比較，兩個(gè)單一指標(biāo)與聯(lián)合指標(biāo)相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明在3種指標(biāo)中，聯(lián)合指標(biāo)與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系較兩種單一指標(biāo)更為密切。因此，將血清標(biāo)志物與臍動(dòng)脈血流聯(lián)合用于預(yù)測(cè)上述不良妊娠結(jié)局，其效果應(yīng)優(yōu)于兩種指標(biāo)單獨(dú)應(yīng)用。至于其具體篩查效果如敏感度、特異度等，仍需進(jìn)一步評(píng)估。

在臨床工作中，如中孕期唐氏綜合征篩查中血清標(biāo)志物升高(≥2 MoM)，在排除了染色體及胎兒結(jié)構(gòu)異常后，應(yīng)密切關(guān)注孕14至28周的孕中期臍動(dòng)脈血流檢測(cè)，如有一項(xiàng)或多項(xiàng)指標(biāo)異常時(shí)，與子癇前期、胎兒生長(zhǎng)受限、新生兒窒息、胎盤異?；蛱簛G失的不良妊娠結(jié)局關(guān)系密切，應(yīng)視為高危妊娠處理，告知患者相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，適當(dāng)增加產(chǎn)前檢查次數(shù)，注意與胎盤功能有關(guān)的檢查如彩色多普勒超聲觀察胎盤形態(tài)、復(fù)查臍動(dòng)脈血流等。

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篇3

研究目的：本研究擬在大腸桿菌中表達(dá)FimA蛋白并進(jìn)行蛋白純化。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備抗FimA蛋白的多克隆抗體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

研究方法：1. 以大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為宿主菌，用IPTG誘導(dǎo)fimA表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot來(lái)驗(yàn)證蛋白的表達(dá)結(jié)果，并進(jìn)行蛋白表達(dá)形式分析。2. 大量誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，用Co2+柱親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物，通過(guò)SDS-PAGE和Western blot來(lái)驗(yàn)證純化產(chǎn)物，純化產(chǎn)物經(jīng)透析復(fù)性后用BCA法蛋白定量試劑盒作蛋白含量測(cè)定。

研究結(jié)果：1. 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，工程菌在SDS-PAGE上出現(xiàn)一條新蛋白帶，分子量與預(yù)期大小基本一致（約41kDa），IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)融合蛋白表達(dá)量影響較大：當(dāng)IPTG濃度為2 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí)蛋白表達(dá)量最大；當(dāng)IPTG濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為1 h時(shí)蛋白表達(dá)量最小。6×His-FimA表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應(yīng)位置呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，可見(jiàn)一明顯蛋白條帶，而空質(zhì)粒pET-15b對(duì)應(yīng)位置未見(jiàn)特異條帶。蛋白表達(dá)形式分析結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白位于包涵體中。2. 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析， SDS-PAGE上出現(xiàn)一致的單一條帶，其分子量大小與預(yù)期相符（約41kDa）。6×His-FimA純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，X線片感光，在X線片上相應(yīng)位置呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，可見(jiàn)一明顯蛋白條帶，條帶位置與BL21(DE3)pLysS全菌誘導(dǎo)表達(dá)后相應(yīng)蛋白位置一致。經(jīng)BCA法蛋白濃度定量試劑盒對(duì)純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，計(jì)算出純化后的FimA蛋白濃度為0.96 mg/ml。

主要結(jié)論：用本課題組前期構(gòu)建的fimA基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-15b-fimA，在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中誘導(dǎo)表達(dá)后，fimA基因能夠得到正確表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Co2+柱親和層析，可以得到帶6×His標(biāo)簽的FimA融合蛋白。

1 緒論

慢性牙周炎是導(dǎo)致成人牙齒功能喪失的主要原因之一，在我國(guó)有很高的發(fā)病率，嚴(yán)重影響國(guó)民健康水平。牙周炎造成的牙周組織的破壞是持續(xù)性的，一旦發(fā)生，目前的治療手段還不能使牙周組織達(dá)到完全的恢復(fù)。牙周炎還可能是某些系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人民生活水平的提高和人群壽命的延長(zhǎng)，對(duì)牙周健康狀況的關(guān)注日益提高。因此，探索預(yù)防慢性牙周炎的有效途徑對(duì)于提高國(guó)民健康水平具有重要意義。

疫苗在人和家畜疾病防治方面具有極大的作用，是一種有效的防治疾病的手段。從減毒活疫苗、死疫苗、亞單位疫苗、重組疫苗到DNA疫苗，由于技術(shù)不斷改進(jìn)，使得疫苗有了廣泛的應(yīng)用，被成功的用于許多細(xì)菌或病毒感染的防治，因此以疫苗來(lái)防治牙周炎也已成為一個(gè)重要思路。

慢性牙周炎是一種細(xì)菌感染性疾病，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis， Pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是Pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，F(xiàn)imA)是其主要亞單位，能夠介導(dǎo)Pg對(duì)宿主組織的粘附與入侵，以及與口內(nèi)其他細(xì)菌的粘附共聚[1-3]，還能刺激炎性因子的產(chǎn)生[4]。多菌毛Pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而無(wú)菌毛的突變菌株則不會(huì)造成牙槽骨的破壞。也有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用FimA免疫大鼠可減輕由Pg引起的牙槽骨破壞[5]，將抗FimA的單克隆抗體用于口腔被動(dòng)免疫，可以抑制該菌在口腔的定植[6]。因此，可以將FimA作為防治牙周炎疫苗抗原。

Pg菌毛的單體是FimA，由單拷貝fimA基因編碼。fimA基因全長(zhǎng)1290 bp，開放讀框包括1044 bp，編碼347個(gè)氨基酸。翻譯后產(chǎn)物菌毛蛋白的功能域（如刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的位點(diǎn)、刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生的位點(diǎn)等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各個(gè)位點(diǎn)之間可相互交叉或覆蓋。近年來(lái)由于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，fimA基因已被克隆和測(cè)序，對(duì)蛋白質(zhì)分子中的各個(gè)功能區(qū)、抗原表位已有了更深入的了解，為研制疫苗提供了可靠的依據(jù)。

根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，在前期已構(gòu)建fimA原核表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，本研究擬在大腸桿菌BL21（DE3）pLysS中表達(dá)FimA融合蛋白，并通過(guò)金屬螯合親和層析技術(shù)進(jìn)行純化，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)制備抗FimA蛋白的多克隆抗體、研發(fā)用于人類的、可有效防治牙周炎的DNA疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2 文獻(xiàn)回顧

牙周炎是口腔疾病中的常見(jiàn)病和多發(fā)病，在我國(guó)有很高的發(fā)病率[7]。牙周炎累及牙齒數(shù)目多，預(yù)后差，是造成牙齒缺失的主要原因。隨著我國(guó)進(jìn)入老齡化社會(huì)，牙周炎的預(yù)防將成為突出的保健問(wèn)題。世界衛(wèi)生組織已將牙周組織健康列為健康人的十項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)之一[7]。探索預(yù)防和治療這種嚴(yán)重危害人類口腔健康的疾病的方法，對(duì)于改善我國(guó)人民的口腔健康水平，提高人們的生活質(zhì)量有著重要意義。

大量的實(shí)驗(yàn)研究、流行病學(xué)資料和臨床觀察表明[7]，牙周炎是菌斑微生物引起的感染性疾病。菌斑微生物是引發(fā)牙周炎的始動(dòng)因子，是造成牙周組織破壞的必須因素。牙周菌斑中絕大多數(shù)細(xì)菌為口腔固有菌叢，對(duì)宿主無(wú)不良影響，僅少數(shù)細(xì)菌與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis， Pg）是目前獲得公認(rèn)的一種牙周致病菌，它是牙周病，尤其是成人慢性牙周炎病變區(qū)或活動(dòng)部位最主要的優(yōu)勢(shì)病原菌，而健康齦溝內(nèi)很少[7， 8]。目前牙齦卟啉單胞菌也是牙周微生物學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)研究的厭氧菌之一。除口腔疾病外，在全身系統(tǒng)性疾病的研究中，血清學(xué)、動(dòng)物模型、細(xì)胞培養(yǎng)的研究證實(shí)[9-11] Pg感染與心腦血管疾病的發(fā)生有關(guān)，而且有學(xué)者報(bào)道[12]Pg的感染與低體重嬰兒的分娩也有關(guān)。

Pg含有大量毒性因子，如蛋白酶、菌毛、脂多糖、血凝素等。其中菌毛在牙周致病作用中占據(jù)重要地位，而且與Pg在口腔的定植有關(guān)，為Pg的優(yōu)勢(shì)抗原之一。另外，因其具有廣泛的生物學(xué)活性而成為牙齦卟啉單胞菌研究的一個(gè)熱點(diǎn)。

菌毛（pili，fimbriae）是位于革蘭氏陰性菌Pg菌體表面的一種彎曲的、單股的絲狀物，長(zhǎng)0.3～1.0 μm，直徑為3.5～5.0 nm，遍布細(xì)菌表面，多者每菌可有數(shù)百根，由菌體表面伸向細(xì)胞外。其化學(xué)組分是一種蛋白質(zhì)，與細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)無(wú)關(guān)。

2.1 菌毛的致病機(jī)制 2.1.1 介導(dǎo)Pg附著于口腔

Pg附著于宿主組織表面是其定植于口腔的關(guān)鍵，也是其致病的先決條件。Pg可選擇性的直接附著于口腔內(nèi)特定部位組織的表面，或識(shí)別已經(jīng)附著在組織表面的細(xì)菌，然后間接的附著于組織表面。

1）菌毛可介導(dǎo)Pg附著于口腔內(nèi)各種組織細(xì)胞的表面

菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；唾液中的重要蛋白質(zhì)成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG、富酪蛋白PRT）；乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECM）（如玻連蛋白和纖維連接蛋白）。人細(xì)胞外基質(zhì)蛋白通過(guò)與FimA受體配體的結(jié)合在細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。菌毛對(duì)基質(zhì)蛋白有很強(qiáng)的親和力，而且明顯抑制玻連蛋白/纖維連接蛋白與其受體αβ3和配體α5β（在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CHO細(xì)胞株中過(guò)度表達(dá)）的相互結(jié)合。在牙周組織中，菌毛可能通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白受體/配體途徑阻斷細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

菌毛還可介導(dǎo)Pg黏附于牙齦上皮細(xì)胞、牙周袋上皮細(xì)胞、人口腔上皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，附著并凝集人或羊的紅細(xì)胞等。Umemoto[13]構(gòu)建了無(wú)菌毛的Pg突變株，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人口腔上皮癌細(xì)胞的黏附性和侵襲性均降低，接種小鼠后引起牙槽骨喪失的量也減少。其他學(xué)者構(gòu)建了不表達(dá)菌毛的Pg缺陷株，發(fā)現(xiàn)它們黏附和侵襲人牙齦成纖維細(xì)胞[14]、上皮細(xì)胞[15]、內(nèi)皮細(xì)胞[16]和樹突狀細(xì)胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。這些研究結(jié)果說(shuō)明菌毛在Pg黏附于口腔上皮細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用。

此外，研究發(fā)現(xiàn)Pg可黏附于唾液覆蓋的羥基磷灰石（hydroxyapatite coated with saliva，sHAP），這種黏附活動(dòng)常被作為研究Pg與口腔內(nèi)唾液覆蓋的各種組織細(xì)胞黏附活動(dòng)的模型。Lee[18]等的研究發(fā)現(xiàn)，Pg與羥基磷灰石之間的這種黏附活動(dòng)需要菌毛參與，而且抗菌毛的抗體能完全抑制這種黏附作用。學(xué)者們[14， 16]通過(guò)同源重組技術(shù)滅活fimA基因后，發(fā)現(xiàn)突變株與sHAP的黏附能力降低。這些研究結(jié)果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆蓋的口腔內(nèi)各種組織表面的過(guò)程中起重要作用。

2）在菌斑形成的早期，菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于附著在獲得性膜表面的細(xì)菌，間接的附著于組織表面

細(xì)菌之間的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。鏈球菌是最先定植于牙齒表面的主要細(xì)菌，Pg通過(guò)菌毛與鏈球菌細(xì)胞表面的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）高親合力、高特異性的結(jié)合而與鏈球菌發(fā)生共聚，這種相互作用在Pg定植于牙周袋的過(guò)程中可能起重要作用。此外菌毛還參與Pg與放線菌、福賽氏類桿菌之間的黏附過(guò)程。

3）有關(guān)黏附機(jī)制的研究

現(xiàn)在已經(jīng)明確Pg黏附于口腔的過(guò)程為一種特異性識(shí)別過(guò)程，菌毛可能為特異性配體，與宿主細(xì)胞膜上的特異性受體相互作用[7]。部分Pg菌毛可識(shí)別的黏附受體現(xiàn)已明確，如βintegrins[7，19]、上皮細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白14[20]、巨噬細(xì)胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通過(guò)上皮細(xì)胞的βintegrins促進(jìn)Pg與牙齦上皮細(xì)胞的黏附，抗βintegrins的抗體能抑制Pg的黏附和侵襲[19]。Pg菌毛通過(guò)單核細(xì)胞上的TLR2、CD14和CD11a/CD18，誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞IL-6 mRNA的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的分泌、p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究表明，β2 integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬細(xì)胞與Pg菌毛黏附的細(xì)胞受體；而且β鏈（CD18）在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，菌毛可介導(dǎo)Pg黏附于齦溝液中的成分（如人血紅蛋白和纖維蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白；宿主細(xì)胞（如牙齦上皮細(xì)胞、牙周袋上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等）；口腔內(nèi)的細(xì)菌（如鏈球菌、放線菌、福賽氏類桿菌）。借助于菌毛黏附于這些物質(zhì)，Pg可在口腔內(nèi)進(jìn)一步定植、侵襲、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

2.1.2 引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)

Pg附著于口腔內(nèi)組織細(xì)胞后，其抗原成分和毒性產(chǎn)物等可引發(fā)白細(xì)胞的趨化、吞噬等炎癥過(guò)程，造成表面組織的損傷——其中Pg菌毛能與脂多糖一起激活宿主的防御機(jī)制、誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生；此外細(xì)菌及其產(chǎn)物還通過(guò)上皮細(xì)胞或者細(xì)胞間質(zhì)進(jìn)入表層下組織，在組織內(nèi)繁殖，甚至擴(kuò)散至全身。

1）Pg菌毛的白細(xì)胞趨化作用

牙周炎再現(xiàn)了一種重要的中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的破壞宿主組織細(xì)胞的模型。牙周炎的優(yōu)勢(shì)病原菌P生的毒力因子主要就是用于調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞的反應(yīng)。其中Pg菌毛能誘導(dǎo)多種可趨化白細(xì)胞至炎癥部位的細(xì)胞因子的分泌。

Pg菌毛可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)趨化因子IL-8（Interleukin-8）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）：感染了野生型Pg的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)低劑量的表達(dá)IL-8和MCP-1，而Pg的fimA基因突變株則不能誘導(dǎo)IL-8和MCP-1產(chǎn)生。同時(shí)，抗菌毛的特異性抗體也能阻斷上述因子的產(chǎn)生。這些提示IL-8和MCP-1的產(chǎn)生是由菌毛特異性引起的。

IL-8和MCP-1都是誘導(dǎo)白細(xì)胞到免疫反應(yīng)部位的有效的趨化因子。MCP-1又稱單核細(xì)胞趨化激活因子（monocyte chemoattractant activating factor， MCAF），它作為趨化因子超家族的一個(gè)主要成員，可以由機(jī)體多種細(xì)胞合成和分泌（如人牙齦上皮細(xì)胞），是重要的炎性細(xì)胞因子，在機(jī)體對(duì)入侵的病原微生物的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中，起重要調(diào)節(jié)作用。MCP-1的主要生理作用是特異性的趨化中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集， 同時(shí)還有激活巨噬細(xì)胞的功能。而且炎癥部位的細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α等可以刺激機(jī)體的免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞表達(dá)MCP-1，該過(guò)程中所產(chǎn)生的MCP-1能進(jìn)一步特異性的趨化巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞向病損部位聚集。中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集，是炎癥反應(yīng)中的一個(gè)重要過(guò)程。巨噬細(xì)胞是參與牙槽骨代謝的重要的免疫細(xì)胞，被激活的巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生大量的骨吸收性細(xì)胞因子。也有學(xué)者認(rèn)為巨噬細(xì)胞是破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞，在破骨細(xì)胞分化因子的存在下，體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞可以向破骨細(xì)胞分化。而牙槽骨的吸收是牙周病的一個(gè)重要病理特點(diǎn)，是病變進(jìn)程、發(fā)展和愈后的一個(gè)重要指標(biāo)。這些提示Pg菌毛能通過(guò)免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞產(chǎn)生的MCP-1間接的趨化巨噬細(xì)胞向炎癥部位聚集，增加破骨細(xì)胞的數(shù)量，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和成熟，進(jìn)而促進(jìn)牙槽骨的吸收。

Pg菌毛可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子ICAM-1、VCAM-1和選擇素（selectin）：Pg菌毛誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）以及P-selectin/E-selectin。而且加入按照人工合成的菌毛氮末端氨基酸序列多肽能上調(diào)上述分子的表達(dá)，而Pg 的fimA基因突變株或含有抗Pg菌毛蛋白抗體的血清與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，不能誘導(dǎo)上述分子的表達(dá)。

內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)上述分子selectin，ICAM-1和VCAM-1可誘導(dǎo)和趨化血液循環(huán)中的白細(xì)胞黏附至內(nèi)皮細(xì)胞。其中選擇素是血管粘附分子大家族中的一大類成員，根據(jù)表達(dá)部位可分為三類[21]：表達(dá)于活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面的E-selectin；表達(dá)于白細(xì)胞表面的L-selectin；表達(dá)于活化的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞表面的P-selectin。在感染以及其他炎性反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中，selectin通過(guò)與其相應(yīng)配體結(jié)合介導(dǎo)白細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、T-和B-淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞等）與血管壁（特別是毛細(xì)血管后靜脈）接觸，并使白細(xì)胞在血管壁上緩慢滾動(dòng)，從而啟動(dòng)一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致白細(xì)胞在炎性反應(yīng)區(qū)域集中。ICAM-1也可促進(jìn)白細(xì)胞黏附、移動(dòng)和趨化至炎癥部位。血液循環(huán)中的單核細(xì)胞和白細(xì)胞黏附和趨化至內(nèi)皮細(xì)胞，然后穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞在局部聚集是炎癥反應(yīng)的重要過(guò)程。Pg菌毛通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞所表達(dá)的selectin、VCAM-1和ICAM-1，趨化單核細(xì)胞和白細(xì)胞至炎癥反應(yīng)的局部，可能在牙周病中起重要作用。

2）Pg菌毛誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生

（1）Pg菌毛誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學(xué)趨化因子IL-8，誘導(dǎo)p38促有絲分裂蛋白激酶磷酸化，刺激單核細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p50和p65亞單位的活化（通過(guò)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑），從而誘導(dǎo)高滴度的NF-κB依賴性細(xì)胞因子的釋放。NF-κB是細(xì)胞中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是Rel家族的成員，幾乎存在于所有細(xì)胞中，在免疫反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)中起主導(dǎo)作用，可在炎癥部位高度表達(dá)，提示其在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。受NF-κB調(diào)節(jié)的炎性細(xì)胞因子有：腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α和TNF-β）；粘附分子（ICAM-1，VCAM，E-selectin）；白介素（IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-12）；集落刺激因子（CSF）（粒細(xì)胞-CSF，粒細(xì)胞和單細(xì)胞-CSF）；β-干擾素（INF-β）等。因此，NF-κB是多種促炎癥基因高度轉(zhuǎn)錄的必須因子。同時(shí)，由NF-κB調(diào)節(jié)的產(chǎn)物，如TNF-α和IL-1β又能激活NF-κB，這就意味著存在一個(gè)能放大且延續(xù)炎癥反應(yīng)的復(fù)雜的調(diào)節(jié)環(huán)路。

（2）Pg菌毛還能通過(guò)TLR2信號(hào)途徑誘導(dǎo)小鼠腹膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生RANTES、INF-γ、IL-17、VCAM-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)MCP-1 mRNA的強(qiáng)表達(dá)。CD18可能在相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起重要作用。Pg菌毛可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株U937表達(dá)IL-1β，IL-8，IL-12和TNF-α。fimA基因正常表達(dá)的Pg菌株能誘導(dǎo)單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞表達(dá)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6，免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-10和趨化因子IL-8，而fimA基因的突變菌株P(guān)g DPG3就不能誘導(dǎo)上述細(xì)胞因子的表達(dá)。而且用菌毛蛋白刺激單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞，能在自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）和自體的CD4+ T細(xì)胞中誘導(dǎo)以IFN-γ為主要細(xì)胞因子的Th1-型免疫反應(yīng)。

關(guān)于菌毛誘導(dǎo)各種炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生的機(jī)制，Hajishengallis[22]的研究表明：體內(nèi)免疫系統(tǒng)的Toll-like receptors（TLRs）和其他模式識(shí)別受體（pattern-recognition receptors，PRRs）組成了一種功能性受體復(fù)合物，識(shí)別并對(duì)病原菌相關(guān)模式分子（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）起反應(yīng)。在這種相互作用中，菌毛作為一種病原菌相關(guān)模式分子與宿主細(xì)胞的模式識(shí)別受體復(fù)合物相結(jié)合。CD14和CD11b/CD18是一種募集性受體，TLRs則是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。TLR2和TLR4與介導(dǎo)菌毛活化細(xì)胞有關(guān)，其他的模式識(shí)別受體如CD14和CD11b/CD18與介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)菌毛的識(shí)別有關(guān)。菌毛通過(guò)激活TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和化學(xué)趨化因子IL-8，并誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞中協(xié)同刺激性分子CD40、CD80和CD86表達(dá)的上調(diào)。此研究結(jié)果也提示菌毛對(duì)宿主免疫系統(tǒng)有潛在的“危害”。

3）Pg菌毛誘導(dǎo)多種與調(diào)節(jié)骨代謝有關(guān)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生，改變牙槽骨的代謝，誘導(dǎo)骨的吸收

Pg菌毛所誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子如IL-1、TNF-α是骨重建中重要的局部調(diào)節(jié)因子，在牙槽骨的吸收破壞中起重要作用，可促進(jìn)結(jié)締組織基質(zhì)的降解，刺激骨的吸收，與牙周炎密切相關(guān)[1]；IL-1、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子還可通過(guò)自分泌和旁分泌途徑，刺激更多的IL-1、IL-8、TNF-α的產(chǎn)生，使炎癥加重和擴(kuò)大，引起組織的進(jìn)一步破壞。提純的菌毛蛋白還能濃度依賴性的誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF/SF的產(chǎn)生。HGF/SF，也名為趨化因子SF，由間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，主要作用于上皮細(xì)胞，與刺激破骨細(xì)胞的活化有關(guān)。

Evans[23]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)菌毛的Pg能誘導(dǎo)無(wú)菌鼠牙槽骨喪失，而不產(chǎn)生菌毛的Pg誘導(dǎo)無(wú)菌鼠牙槽骨喪失的能力顯著降低，而且用提純的菌毛蛋白免疫無(wú)菌鼠可預(yù)防Pg所導(dǎo)致的牙周組織的破壞。這也證實(shí)了菌毛與牙槽骨的吸收密切相關(guān)。

4）Pg菌毛抑制單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡可能與慢性炎癥性疾病密切相關(guān)。在缺乏生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液中，Pg菌毛蛋白可抑制人單核細(xì)胞THP-1的凋亡。這種抑制作用能被抗菌毛蛋白的抗體所完全抑制。菌毛可激活細(xì)胞外信號(hào)傳導(dǎo)激酶（signal-regulated kinase，ERK），刺激細(xì)胞內(nèi)依賴細(xì)胞周期的蛋白激酶抑制劑p21的表達(dá)，從而阻斷單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡，提示菌毛可阻斷單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的凋亡，是慢性炎癥性疾病牙周病的一種重要的調(diào)節(jié)分子。

5）Pg菌毛誘導(dǎo)免疫反應(yīng)

慢性牙周炎與牙齦卟啉單胞菌感染不成熟樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）、誘導(dǎo)真皮下DCs和基底膜中成熟的DCs數(shù)量的增加有關(guān)。Jotwani[24]的研究證實(shí)fimA基因正常表達(dá)的菌株P(guān)g381與fimA基因的突變菌株P(guān)gDPG3相比，能更高效進(jìn)入單核細(xì)胞來(lái)源的樹突狀細(xì)胞（monocyte-derived dendritic cells，MDDCs）中，誘導(dǎo)DCs的成熟。Pg381感染MDDCs后，能誘導(dǎo)高水平的自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，誘導(dǎo)Th1-型免疫反應(yīng)。用菌毛蛋白刺激MDDCs，也能誘導(dǎo)DCs成熟，而且成熟的MDDCs還能誘導(dǎo)自體同源性CD4+T細(xì)胞的增殖，γ-干擾素（gamma interferon，IFN-γ）的釋放。這些結(jié)果提示Pg菌毛可能在誘導(dǎo)MDDCs吞噬Pg和誘導(dǎo)Th1-型免疫反應(yīng)中起重要作用。

Amano[25]報(bào)導(dǎo)在牙周炎病人體內(nèi)能檢測(cè)到高滴度的抗菌毛的特異性IgG和IgA抗體。Condorelli[26]報(bào)導(dǎo)在牙周炎病人71.7%活動(dòng)性位點(diǎn)和58.7%非活動(dòng)性位點(diǎn)的齦溝液（gingival crevicular fluid ，GCF）中能檢測(cè)到抗Pg菌毛的特異性IgA抗體，而在健康對(duì)照組的所有位點(diǎn)的GCF中均不能檢測(cè)到抗菌毛的特異性IgA抗體。這些流行病學(xué)研究的結(jié)果表明Pg菌毛具有良好的免疫原性，能在體內(nèi)誘發(fā)免疫反應(yīng)。

Pg菌毛所誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有保護(hù)作用：Evans[23]等用提純的菌毛蛋白和一種人工合成的20個(gè)氨基酸的菌毛多肽免疫無(wú)菌鼠后，鼠血清中抗菌毛的特異性抗體滴度較用全菌免疫后鼠血清中的抗體滴度高3～4倍。當(dāng)給無(wú)菌鼠口腔接種Pg后，菌毛免疫鼠的牙周組織未受到破壞。Yanagita[27]以菌毛蛋白鼻腔黏膜免疫小鼠（霍亂毒素CT為免疫佐劑），能在黏膜效應(yīng)組織（包括鼻腔通道，頜下腺）的CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)Th1-/Th2-型免疫反應(yīng)。而且頜下腺產(chǎn)生的抗原特異性的IgA多克隆抗體可抑制Pg黏附于上皮細(xì)胞，減少上皮細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生。提示菌毛是一種有潛力的研制牙周炎疫苗的候選免疫原。

6）Pg菌毛誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的形成

有學(xué)者報(bào)導(dǎo)Pg的感染與動(dòng)脈粥樣硬化[28]的發(fā)生有關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化是一種由血管壁開始的慢性炎癥性反應(yīng)，其中泡沫細(xì)胞的形成是其重要特點(diǎn)。Giacona[28]研究證實(shí)人體巨噬細(xì)胞在感染野生型Pg后，形成泡沫細(xì)胞的量明顯增加，但是感染fimA基因的突變菌株P(guān)g DPG3后沒(méi)有明顯的變化，提示菌毛是Pg誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成的必須因素，Pg菌毛可能與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)。

2.2 有關(guān)fimA基因表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展

Pg fimA基因的表達(dá)途徑有以下三種[29]（按照表達(dá)和裝配系統(tǒng)分類）：陪伴/引導(dǎo)分子途徑系統(tǒng)、第二分泌系統(tǒng)、核化依賴聚合系統(tǒng)。fimA基因表達(dá)的初始產(chǎn)物具有非常長(zhǎng)的前序列。Pg蛋白酶參與fimA基因的翻譯后處理、轉(zhuǎn)運(yùn)和裝配[29]。fimA基因的表達(dá)還受到以下因素的影響。

1）局部理化環(huán)境對(duì)Pg fimA基因表達(dá)的影響

研究表明[30]，Pg fimA基因的表達(dá)及菌毛依賴性表型的活性均受到溫度、離子濃度等環(huán)境條件的影響。

齦下區(qū)的溫度并不恒定，常隨牙齒部位及炎癥程度而變[31]，健康齦下區(qū)溫度一般在34℃～37℃，而炎性牙周袋內(nèi)溫度　可達(dá)39℃。Xie等[32]通過(guò)fimA啟動(dòng)子-lacZ受體基因融合研究環(huán)境因素對(duì)Pg fimA基因表達(dá)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)齦下區(qū)溫度由34℃升至39℃時(shí)，Pg fimA基因表達(dá)可減少至1/10。Murakami等[33， 34]的研究同樣證實(shí)溫度升高時(shí)，基因fimA的表達(dá)水平降低。Amano等[35]報(bào)導(dǎo)溫度從37℃提高到39℃時(shí)，Pg對(duì)唾液成分和鏈球菌的黏附能力降低，Pg在牙周炎病人的血清中的抗原性發(fā)生改變。溫度影響DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)，改變組蛋白與DNA結(jié)合的活性[36]，從而降低基因轉(zhuǎn)錄的速度[37]。Pg根據(jù)溫度的變化來(lái)調(diào)整fimA基因表達(dá)的水平，可能是在機(jī)體感染Pg早期，fimA基因表達(dá)水平較高，有利于Pg黏附及侵入牙周組織；隨著炎癥程度加重、牙周袋形成和局部溫度升高，菌毛的產(chǎn)生受到遏制，從而使菌毛的某些功能特性發(fā)生改變，而有利于Pg的生存。

基因fimA的表達(dá)還在轉(zhuǎn)錄水平受氯化高鐵血紅素濃度的調(diào)節(jié)[38]。鐵在Pg的生長(zhǎng)繁殖和毒力中起關(guān)鍵作用，Pg以血紅素的形式吸收鐵[39]。McKee[40]等發(fā)現(xiàn)，Pg在氯化高鐵血紅素過(guò)量時(shí)，毒力增強(qiáng)。在氯化高鐵血紅素不足時(shí)，Pg生長(zhǎng)速度降低，Pg菌體表面菌毛數(shù)量減少[40]，血凝素基因hagB和hagC的mRNA表達(dá)水平降低[41]，但是，致病因子如溶血素和胰蛋白酶樣蛋白酶等的數(shù)量及其致病毒力均明顯增加[42， 43]。為進(jìn)一步闡明氯化高鐵血紅素在調(diào)節(jié)fimA基因表達(dá)中的作用，Xie等[38]研究了fimA基因的轉(zhuǎn)錄活性，結(jié)果顯示在缺乏氯化高鐵血紅素的情況下，fimA啟動(dòng)子活性降低50%，表明氯化高鐵血紅素可以對(duì)Pg fimA基因表達(dá)起正調(diào)控作用。但是這種調(diào)控作用不如溫度變化對(duì)其影響的程度明顯。雖然在氯化高鐵血紅素缺乏時(shí)，Pg的生長(zhǎng)速度降低，但此時(shí)fimA啟動(dòng)子活性降低與Pg生長(zhǎng)速度的降低并沒(méi)有直接的聯(lián)系[38]，fimA啟動(dòng)子的活性并不依賴于Pg的生長(zhǎng)階段。氯化高鐵血紅素調(diào)節(jié)Pg fimA基因表達(dá)的具體分子機(jī)制仍不清楚，許多受離子調(diào)控的基因在其啟動(dòng)子區(qū)均存在“離子盒”，而在fimA啟動(dòng)子區(qū)并沒(méi)有與此具有同源性的區(qū)域結(jié)構(gòu)[44]。推測(cè)可能是由于Pg多種致病因子基因的表達(dá)共同受到氯化高鐵血紅素的調(diào)節(jié)所致。

影響Pg fimA基因表達(dá)的局部理化環(huán)境還包括血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等。

關(guān)于Pg如何感受到環(huán)境的變化，并把這種信息傳遞給細(xì)胞的機(jī)理并不完全清楚。但是研究發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的兩種成分FimS-FimR與Pg fimA基因的表達(dá)有關(guān)[45]。FimS是一種組氨酸蛋白激酶基因的等位基因，F(xiàn)imR是反應(yīng)調(diào)節(jié)基因的等位基因[45]。FimS 和FimR的分裂會(huì)導(dǎo)致菌毛形成量的明顯降低。fimA基因的表達(dá)可能受到FimR反應(yīng)調(diào)節(jié)器的正調(diào)控[46]。FimR調(diào)控包括fimA基因位點(diǎn)周圍的5個(gè)成串的基因——fimA cluster在內(nèi)的多個(gè)基因的表達(dá)。染色體免疫沉淀反應(yīng)和電泳分析表明，菌毛蛋白黏附到fimA cluster中的第一個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域。突變菌株的基因表達(dá)分析表明，fimA基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程包括多個(gè)步驟，F(xiàn)imR基因上調(diào)fimA cluster中的第一個(gè)基因的表達(dá)，而此基因編碼一個(gè)在fimA基因的表達(dá)中起關(guān)鍵作用的調(diào)控蛋白。

2）其他口腔微生物對(duì)Pg fimA基因表達(dá)的調(diào)控

牙菌斑是一種附著了各種細(xì)菌的生物膜，這些菌斑微生物之間可以通過(guò)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制互相影響。Pg通過(guò)與獲得性薄膜中的唾液分子[25]或者先前定殖的細(xì)菌如口腔鏈球菌[1]相接觸而定殖于牙菌斑生物膜中，然后與牙菌斑生物膜中的其他微生物共生。但是，Pg不能聚集于鏈球菌突變株或者S.cristatus這一底層的上面[47]。針對(duì)這一現(xiàn)象的進(jìn)一步研究揭示鏈球菌S.cristatus CC5A能明顯降低Pg的fimA基因的表達(dá)水平，其濃度與fimA基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，濃度升高時(shí)甚至可使fimA啟動(dòng)子活性下降1/2[48]。但是，在實(shí)驗(yàn)中尚未發(fā)現(xiàn)菌斑中的其他細(xì)菌，如纖細(xì)鏈球菌G9B和M5、血鏈球菌10556、變形鏈球菌KPSK2、內(nèi)氏放線菌NC-3、齒垢密螺旋體GM-1以及具核梭桿菌10953等對(duì)fimA基因的表達(dá)具有這種調(diào)控作用[49]。

目前的研究結(jié)果認(rèn)為，S.cristatus CC5A與Pg之間的這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)開始于Pg受體對(duì)CC5A信號(hào)的識(shí)別[47]。信號(hào)分子是鏈球菌S.cristatus細(xì)胞膜表面的一種分子量為59kDa的CC5A蛋白，與其他革蘭氏陽(yáng)性菌分泌的短信號(hào)肽有明顯區(qū)別[49]。菌毛自身并非受體，fimA基因突變的Pg株與CC5A蛋白的結(jié)合與野生型Pg菌株與CC5A蛋白的結(jié)合沒(méi)有區(qū)別。這些結(jié)果表明，早期共生菌斑和后期致病性菌斑中的許多細(xì)菌并不影響fimA啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的活性，不影響Pg菌毛的產(chǎn)生，因而能夠與Pg相互共存。但是，S.cristatus CC5A能特異性地使Pg fimA表達(dá)水平降低，從而影響菌毛的產(chǎn)生，阻止Pg在菌斑內(nèi)的進(jìn)一步的繁殖。

3）Pg自身產(chǎn)物對(duì)fimA基因表達(dá)的調(diào)控

目前，定點(diǎn)誘變?cè)囼?yàn)表明[50]，在fimA基因上游區(qū)域存在一個(gè)σ70-識(shí)別的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，研究證明，調(diào)節(jié)蛋白能夠與此位點(diǎn)特異性的結(jié)合，從而影響RNA聚合酶的功能。Xie等[48]發(fā)現(xiàn)有三種蛋白可結(jié)合于fimA基因，分別是菌毛蛋白、賴氨酸蛋白酶（Kgp）以及精氨酸蛋白酶（Rgp）的翻譯后處理片段。

將外源fimA啟動(dòng)子-LacZ受體插入攜帶fimA突變基因的Pg菌株內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入的外源性fimA啟動(dòng)子不能活化，fimA mRNA表達(dá)水平低；但若僅使fimA結(jié)構(gòu)基因上游區(qū)域產(chǎn)生突變，則不影響啟動(dòng)子的活性，fimA mRNA的表達(dá)水平與野生型菌株相同[48]。提示fimA基因在表達(dá)過(guò)程中，表達(dá)產(chǎn)物可作為調(diào)節(jié)蛋白與自身啟動(dòng)子上游區(qū)的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而正反饋性調(diào)節(jié)Pg fimA基因的表達(dá)。

Pg的半胱氨酸蛋白酶（Rgp和Kgp）也參與調(diào)節(jié)fimA基因的表達(dá)。有研究[51]報(bào)道當(dāng)rgp表達(dá)水平較低時(shí)，Pg表面菌毛數(shù)量減少。rgpA和kgp基因失活的Pg菌株YPP1和YPP2與野生型Pg相比，fimA mRNA表達(dá)水平明顯降低[52]。Pg 381的rgp A基因突變的變異株不表達(dá)菌毛，rgpB基因變異菌株表達(dá)的菌毛水平較野生型菌株低[48]。Tokuda[53]等也證明rgpA單基因突變菌株的fimA mRNA表達(dá)水平下降，表達(dá)的菌毛蛋白很少，通過(guò)Western印跡分析不能檢出菌毛蛋白，其表面的菌毛通過(guò)電鏡也無(wú)法觀測(cè)到。菌株P(guān)g 33277 的rgpA和rgpB雙基因缺陷變異菌株則不表達(dá)菌毛[48]。這些研究結(jié)果均證明蛋白酶可在轉(zhuǎn)錄水平直接影響菌毛蛋白的產(chǎn)生。此外，在菌毛蛋白翻譯后修飾加工的過(guò)程中，Pg蛋白酶還參與到對(duì)菌毛蛋白N-末端氨基酸的修飾加工。

這些資料均表明包括菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶在內(nèi)的幾種Pg來(lái)源的蛋白都是fimA基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)的組成部分，它們能夠與fimA基因的上游區(qū)域結(jié)合，從而影響fimA基因的mRNA表達(dá)水平。

綜上所述，影響Pg fimA基因表達(dá)的因素有：局部理化環(huán)境，包括溫度、氯化高鐵血紅素的濃度、血清、唾液、滲透壓、Ca2+濃度以及pH值等；牙菌斑中的細(xì)菌如S.cristatus CC5A；Pg自身產(chǎn)物，如菌毛蛋白、Rgp和Kgp蛋白酶等。如能對(duì)fimA基因的表達(dá)過(guò)程詳細(xì)研究，在fimA基因轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中加以某種干預(yù)，使Pg菌毛蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯水平降低，或者使fimA基因翻譯后的修飾加工過(guò)程受到干擾，使菌毛所介導(dǎo)的Pg的黏附、侵入降低，病理性作用減少，就有可能降低Pg相關(guān)性牙周炎的發(fā)病率和嚴(yán)重性，這也是未來(lái)的一個(gè)研究方向。

2.3 有關(guān)fimA基因分子克隆的研究進(jìn)展

Dickinson等[54]1988年首次克隆并測(cè)序了Pg381 fimA基因。Fujiwara等[55]1993年克隆并測(cè)序了9種Pg菌株的fimA基因，結(jié)果揭示這9種Pg菌株的fimA基因覆蓋1044～1083 bp，所編碼的多肽分子量為37，527～38，239，菌株之間有一部分相同的序列，同時(shí)具有大量的不同序列。Fujiwara[55]首次按照f(shuō)imA基因核苷酸序列的不同，將Pg分為4種基因型。

Sharma等[56]1993年首次用表達(dá)載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達(dá)了Pg 2561的部分菌毛多肽（氨基酸10～337）。Washington等[57]1993年用表達(dá)載體pET-lld，大腸桿菌BL21表達(dá)了Pg 381 fimA的一部分片段（1 kb）（fimA基因全長(zhǎng)為1044bp）。

Sharma等[58]1996年首次構(gòu)建了表達(dá)部分菌毛多肽的重組鏈球菌——一種活載體疫苗。以pUC13Bg12.1為模板，將編碼Pg 2561 FimA蛋白部分肽段（N-末端55～145[90個(gè)aa]和C-末端233～322殘基[89個(gè)aa]）的基因，PCR擴(kuò)增后，定向插入到鏈球菌（Streptococcus gordonii）M6基因（emm6.1）的Kpn I-Hind III位點(diǎn)，獲得融合表達(dá)質(zhì)粒pSMB55，然后轉(zhuǎn)染于口腔鏈球菌（S. gordonii GP251）中，制備為一種以細(xì)菌為載體的基因工程減毒活疫苗。在鏈球菌M6蛋白（氨基酸1～122和302～441）的錨定區(qū)，表達(dá)菌毛多肽（氨基酸55～145和233～322），形成一種融合蛋白。此鏈球菌所表達(dá)的菌毛多肽可競(jìng)爭(zhēng)性的抑制Pg結(jié)合于唾液覆蓋的羥基磷灰石上。而且將此疫苗菌株口腔內(nèi)免疫無(wú)菌鼠后，可誘導(dǎo)血清異性IgA、IgG抗體和唾液異性IgA抗體的產(chǎn)生，并能防止Pg所導(dǎo)致的牙槽骨的吸收[59]。Sharma等[60]1999年進(jìn)一步在鏈球菌Streptococcus gordonii表面，表達(dá)FimA蛋白的C-末端多肽（226～246），但是實(shí)驗(yàn)證實(shí)這種包含游離半胱氨酸殘基的多肽在鏈球菌的表面表達(dá)很弱。

Kawabata等[61]1999年以克隆質(zhì)粒pSM36為模板克隆了fimA基因，以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3首次構(gòu)建了fimA核酸疫苗pcDNA3/fimA。體外轉(zhuǎn)染NIH3T3真核細(xì)胞后，可檢測(cè)到菌毛蛋白的表達(dá)，說(shuō)明了在真核細(xì)胞中表達(dá)FimA蛋白的可行性。定向唾液腺（TSG）免疫BALB/c小鼠后，成功的誘導(dǎo)了體液免疫和細(xì)胞免疫，在唾液和血清中能檢測(cè)到特異性抗體。免疫后的小鼠，血清中抗FimA特異性IgG抗體主要的亞類是IgG2a，唾液腺單核細(xì)胞Th2-型細(xì)胞因子特異性mRNA增加，脾中產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。

Shin等[62]2005年首次報(bào)道在植物中表達(dá)菌毛多肽。Shin等[62]克隆FimA蛋白的C-末端氨基酸殘基266～337的編碼基因，然后插入到植物的表達(dá)載體中編碼CTB（霍亂毒素B亞單位）的基因片段的下游，然后此嵌合性載體ctb-fimA被轉(zhuǎn)染到馬鈴薯（Solanum tuberosum）細(xì)胞中表達(dá)蛋白。通過(guò)ELISA對(duì)CTB-FimA融合蛋白的定量分析表明，此蛋白占全部可溶性蛋白的0.33%，表達(dá)量較低，尚需要進(jìn)一步改進(jìn)。

國(guó)內(nèi)劉魯川[63]1994年首先以pUC13Bg12.1質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增fimA基因部分片段（504～1045 bp，總擴(kuò)增長(zhǎng)度為542 bp）。

郭紅梅[64]2007年成功的構(gòu)建了FimA蛋白與IL-15真核共表達(dá)質(zhì)粒，以其作為DNA疫苗經(jīng)滴鼻免疫Wistar大鼠，能夠激發(fā)　機(jī)體產(chǎn)生特異性的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，又能激發(fā)粘膜免疫應(yīng)答。疫苗所表達(dá)的IL-15可以作為輔助因子增強(qiáng)sIgA應(yīng)答，對(duì)Pg引起的實(shí)驗(yàn)性牙周炎提供有效的保護(hù)，為解決增強(qiáng)sIgA應(yīng)答來(lái)對(duì)牙周組織提供保護(hù)的難題提供思路。

2.4 有關(guān)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

2.4.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前最常用的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[65] 。大腸桿菌系統(tǒng)由于其遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)方面已充分被人們了解，而且有大量可供選擇的克隆載體與表達(dá)載體，已經(jīng)成為表達(dá)許多異源蛋白質(zhì)的首選表達(dá)系統(tǒng)[66，71]。大腸桿菌遺傳圖譜明確，容易培養(yǎng)且費(fèi)用低，對(duì)許多蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的耐受能力，能高水平的表達(dá)這些蛋白質(zhì)。但是，在實(shí)際工作中，常常需要使外源基因得到最佳的表達(dá)，以滿足人們各種研究需要。此外，許多外源基因在大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，往往不能自發(fā)折疊卷曲生成有一定空間結(jié)構(gòu)的特定功能的蛋白質(zhì)，而是以一種不溶性的沉淀即包涵體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)[67 ，68 ] 。包涵體的形成在某種程度上限制了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。由于處于包涵體中的重組蛋白沒(méi)有生物活性，為使重組蛋白具有生物活性，必須將包涵體復(fù)性，而包涵體的變性、復(fù)性一直困擾著許多科學(xué)工作者[69，70] 。

2.4.2 在大腸桿菌中表達(dá)外源蛋白的優(yōu)化[71]

1）翻譯效率的優(yōu)化：?jiǎn)?dòng)

有效啟動(dòng)翻譯需要起始密碼上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。翻譯起始過(guò)程中，5～9個(gè)核苷酸長(zhǎng)的Shine-Dalgarno序列與16S RNA的3'末端發(fā)生作用。Shine-Dalgarno序列與起始密碼ATG之間的距離對(duì)翻譯效率有影響，在ATG下游插入開放閱讀框架的載體，此段距離已經(jīng)優(yōu)化，如果克隆基因以自身的ATG起始翻譯，起始密碼應(yīng)位于Shine-Dalgarno序列下游5～7個(gè)核苷酸。

翻譯起始區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也影響基因表達(dá)效率。Chen等通過(guò)改變Shine-Dalgarno序列上、下游的核苷酸，減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，提高了基因表達(dá)水平。與此類似，也有一些基因通過(guò)共翻譯，也就是在一段翻譯序列的下游插入目的基因編碼序列，提高了表達(dá)水平。

2）密碼子的使用

遺傳密碼與氨基酸并不是一對(duì)一的關(guān)系，61種密碼子編碼20種氨基酸，而其中只有兩種是由單一密碼子編碼的，其余的18種中的每一種都有多個(gè)密碼子，編碼同一種氨基酸的不同密碼子的使用頻率也是不同的。

如果編碼區(qū)中有大量的或成串兒的稀有密碼子，通過(guò)突變或基因重合成去除這些稀有密碼子，可以提高表達(dá)水平。另外，如果靶序列中有稀有密碼子AGA或AGG，會(huì)帶來(lái)一些特殊問(wèn)題，因?yàn)樗鼈冊(cè)诰幋a區(qū)內(nèi)部又形成額外的Shine-Dalgarno序列。

編碼外源蛋白氨基酸的序列對(duì)表達(dá)水平也有很大影響。因此有必要用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或定點(diǎn)突變的方法，把表達(dá)基因N端的7～8個(gè)密碼子變成大腸桿菌中最常用的密碼子。還應(yīng)盡可能通過(guò)這些方法將靶基因5'端（G+C）含量降至40％以下。

3）培養(yǎng)條件優(yōu)化

在表達(dá)系統(tǒng)相同的情況下，不同的培養(yǎng)基常導(dǎo)致表達(dá)水平的巨大差異。LB類標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基可以用于建立表達(dá)的基本參數(shù)，但只有對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，才能獲得最佳表達(dá)，包括使用基本鹽培養(yǎng)基，如M9，限定鹽培養(yǎng)基，如誘導(dǎo)培養(yǎng)基，或豐富培養(yǎng)基，如肉湯、YT或NZCYM。

一些培養(yǎng)基添加劑能提高某一種特定蛋白的表達(dá)水平。這其中包括濃度在0.1～0.5 mol/L之間的NaCl、不可代謝糖如蔗糖（0.2～0.6 mol/L）、輔助因子（血紅素）和抗生素。Lee和Beckwith注意到，分泌途徑缺陷的抑制基因位于與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的基因上，這些抑制突變的最終效果是降低蛋白合成速率，而低濃度抗生素能在大腸桿菌中模擬它的作用。表達(dá)外源蛋白尤其是分泌蛋白時(shí)，在培養(yǎng)基中加入抗生素，如氯霉素（1 μg/ml）和四環(huán)素（0.1 μg/ml），能降低蛋白合成速率，防止分泌系統(tǒng)過(guò)載，分泌蛋白也就更容易與伴侶分子等結(jié)合，折疊成天然構(gòu)象。最后，培養(yǎng)基的pH也能影響外源蛋白的表達(dá)，當(dāng)LB培養(yǎng)基的pH降至5.5以下時(shí)，可溶性的α-葡萄糖苷酶的表達(dá)量顯著提高。極端pH可能會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)速率降低，從而防止細(xì)菌表達(dá)/加工系統(tǒng)過(guò)載。

在克隆基因的上游插入強(qiáng)的可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子和有效的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，可以在細(xì)菌中表達(dá)非融合蛋白。融合蛋白能大量制備，易于純化，而且能賦予蛋白新的免疫學(xué)或生物學(xué)分析反應(yīng)特性。

2.5 六聚組氨酸融合蛋白的純化

近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展，基因工程重組蛋白的分離純化技術(shù)顯得尤為重要，要將目標(biāo)蛋白從復(fù)雜樣品中快速、特異地純化出來(lái)，就需要選擇合適的蛋白純化方法。

融合標(biāo)簽技術(shù)是20世紀(jì)末興起的一種基于報(bào)告基因的重組DNA技術(shù)。融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展使重組蛋白質(zhì)的純化更加快速、簡(jiǎn)便，并很快得到了應(yīng)用。目前常用的蛋白純化標(biāo)簽是GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶），6×His（六聚組氨酸）和表位標(biāo)簽（如FLAG是專為蛋白純化和檢測(cè)設(shè)計(jì)的八肽，HA是流感病毒血凝素表位等），其中6×His最為常用，帶有6×His標(biāo)簽的融合蛋白可利用固定化金屬鰲合親和層析和免疫親和法進(jìn)行純化。

Porath于1975年首次提出固定化金屬螯合親和層析(IMAC)的概念[72]，該法基于蛋白質(zhì)表面的組氨酸、半胱氨酸、色氨酸等殘基與固定化金屬離子的相互作用而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。其中，組氨酸是與金屬離子作用較強(qiáng)的氨基酸，含有多個(gè)組氨酸的蛋白質(zhì)可在IMAC中有效保留，故人為設(shè)計(jì)的多聚組氨酸便成為最常用的蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽[73]。

免疫親和純化是一種利用抗原抗體特異性可逆結(jié)合特性的技術(shù)，它具有高效、高收率、濃縮效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。在眾多蛋白質(zhì)純化技術(shù)中，免疫親和純化是十分關(guān)鍵的技術(shù)。標(biāo)簽融合蛋白可通過(guò)抗標(biāo)簽的單克隆抗體和多克隆抗體來(lái)純化。多數(shù)免疫親和純化都使用單克隆抗體，但有兩種類型的多克隆抗體可用于免疫親和純化，即針對(duì)合成肽(如6×His、FLAG標(biāo)簽等)或某種抗原的特定區(qū)域產(chǎn)生的抗體。在這兩種情況下，由于結(jié)合到固定化抗體上的抗原位點(diǎn)局限在一個(gè)很小的區(qū)域，因此可實(shí)現(xiàn)有效的洗脫。目前已有商品化的特異性針對(duì)標(biāo)簽的單克隆抗體，但價(jià)格都比較昂貴。

重組蛋白在大腸桿菌（E. coli）高效表達(dá)時(shí)，往往以不溶的、無(wú)活性的蛋白聚集體，即包涵體(inclusion body)的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。必須從細(xì)胞內(nèi)分離出包涵體，采用高濃度變性劑（如7.0 mol/L鹽酸胍、8.0 mol/L脲）溶解包涵體，然后除去變性劑或降低變性劑的濃度，使包涵體蛋白得以復(fù)性，最后再用色譜法使目標(biāo)蛋白質(zhì)得到純化。其中包涵體蛋白的復(fù)性和純化是整個(gè)過(guò)程中的核心。

2.5.1 融合標(biāo)簽技術(shù)

1）融合標(biāo)簽技術(shù)

融合標(biāo)簽技術(shù)是20世紀(jì)末興起的一種基于報(bào)告基因的重組DNA技術(shù)，其主要過(guò)程是利用重組DNA技術(shù)在靶蛋白編碼基因的3'端或5'端融合某種標(biāo)簽的編碼基因，通過(guò)適宜的宿主來(lái)表達(dá)重組蛋白質(zhì)[74-78]，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以通過(guò)融合的標(biāo)簽與包被在固相基質(zhì)上的特異配基結(jié)合而進(jìn)行純化。融合標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展使重組蛋白質(zhì)的純化更加快速、簡(jiǎn)便。近幾年，隨著新的融合標(biāo)簽系統(tǒng)的開發(fā)，其功能逐漸多樣化，除用于蛋白質(zhì)純化外，還用于蛋白質(zhì)定位和檢測(cè)等。

2）融合標(biāo)簽的種類

融合標(biāo)簽根據(jù)其分子量大小可分為兩大類:大的蛋白質(zhì)分子(或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及其衍生物)和小的多肽片段。大的蛋白質(zhì)標(biāo)簽有GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)、SPA(葡萄球菌蛋白A)和GFP(綠色熒光蛋白)等，它的使用會(huì)增加目標(biāo)蛋白的溶解性，但在蛋白結(jié)晶和抗體產(chǎn)生等過(guò)程中，標(biāo)簽必須去除。小的多肽標(biāo)簽有6×His(六聚組氨酸)、HA(流感病毒血凝素表位)、c-myc(人c-myc蛋白表位)、FLAG(專為蛋白純化和檢測(cè)設(shè)計(jì)的八肽)等，多數(shù)情況下，由于多肽標(biāo)簽相對(duì)較小，對(duì)融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響小，不需要從融合蛋白質(zhì)中切除，因而多肽標(biāo)簽較蛋白質(zhì)標(biāo)簽更為常用。迄今為止，己有文獻(xiàn)較為詳盡地報(bào)道了各種融合標(biāo)簽[79，80]，其大小從幾個(gè)氨基酸到蛋白質(zhì)不等，相互作用類型包括酶與底物、細(xì)菌受體與血清蛋白、六聚組氨酸與金屬離子、抗原與抗體等[81]。

3）融合標(biāo)簽技術(shù)用于蛋白的純化

融合標(biāo)簽技術(shù)用于重組蛋白質(zhì)純化已為大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[82-86]。理論上，根據(jù)親和純化原理可定向設(shè)計(jì)使目標(biāo)蛋白質(zhì)與純化基質(zhì)之間不發(fā)生任何直接相互作用的融合標(biāo)簽，以避免由于這種直接相互作用造成蛋白質(zhì)變性。目前已有許多不同的標(biāo)簽可供利用。它們利用了標(biāo)簽與固相配體間的相互作用，從而可從復(fù)雜的提取物中對(duì)標(biāo)簽融合蛋白進(jìn)行選擇性的結(jié)合和洗脫。目前常用的蛋白純化標(biāo)簽是GST，His和表位標(biāo)簽。

最常用的標(biāo)簽是His標(biāo)簽，即多聚組氨酸。該標(biāo)簽由6～10個(gè)連續(xù)組氨酸組成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His標(biāo)簽與其他標(biāo)簽相比有很多明顯優(yōu)勢(shì)：①對(duì)金屬離子如鎳、鈷有高度的選擇性和親和力[87]；②與金屬離子的結(jié)合不受變性劑(尿素、胍)的影響；③溫和多樣的洗脫條件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各種商品化介質(zhì)(Ni-NTA-Agarose，Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His標(biāo)簽的單抗或多抗也被應(yīng)用于His融合蛋白的純化。

GST標(biāo)簽是用來(lái)從細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中純化蛋白較為成功的標(biāo)簽之一。在該系統(tǒng)中，GST與被標(biāo)記的蛋白進(jìn)行融合，融合后的蛋白可在許多表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。GST和谷胱甘肽緊密結(jié)合，融合蛋白可通過(guò)谷胱甘肽固相柱純化，洗脫未結(jié)合的蛋白后，結(jié)合蛋白可用含游離的谷胱甘肽緩沖液進(jìn)行洗脫。該系統(tǒng)中被融合的目標(biāo)蛋白?？烧_的折疊成為有功能的區(qū)域，故十分有用。該系統(tǒng)的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可快速、溫和地純化，且配體谷胱甘肽的成本較低。

表位標(biāo)簽(HA、c－myc和FLAG等)也已廣泛用于融合蛋白的純化研究。目前已有商品化針對(duì)表位標(biāo)簽的單克隆抗體。為使標(biāo)簽在純化中發(fā)揮良好的作用，在純化過(guò)程中應(yīng)盡量避免使用劇烈的條件使抗體和標(biāo)簽之間解離，劇烈的條件可使抗原發(fā)生不可逆變性，目標(biāo)蛋白的回收率低。用游離多肽競(jìng)爭(zhēng)洗脫法洗脫結(jié)合在固相抗體上的標(biāo)簽融合蛋白，是優(yōu)選的方法。

4）融合標(biāo)簽技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

融合標(biāo)簽可提高重組蛋白的產(chǎn)量，由于外源蛋白質(zhì)對(duì)于宿主菌的異質(zhì)性，當(dāng)外源蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)，宿主菌會(huì)調(diào)動(dòng)各種機(jī)制來(lái)阻止外源蛋白質(zhì)過(guò)量表達(dá)，導(dǎo)致的直接后果就是我們所需要的目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量降低。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)外源蛋白質(zhì)融合某些特定的標(biāo)簽后，能夠有效增加重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量[88-90]。

融合標(biāo)簽還可增強(qiáng)重組蛋白質(zhì)的可溶性，外源蛋白質(zhì)在宿主菌內(nèi)表達(dá)時(shí)大多以包涵體形式存在[91]，致使很難獲得大量有活性的天然蛋白質(zhì)。為了防止包涵體形成，一般可以采用低溫誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)，但這種方法并非對(duì)所有蛋白質(zhì)都有效。研究發(fā)現(xiàn)，一些高度可溶的蛋白質(zhì)在與其他蛋白質(zhì)融合后會(huì)促進(jìn)融合蛋白質(zhì)以可溶形式表達(dá)，如MBP等[92，93]。

2.5.2 金屬螯合親和層析技術(shù)

1）金屬螯合親和層析技術(shù)的發(fā)展

1948年，Hearon發(fā)現(xiàn)水溶液中組氨酸和半胱氨酸可與Cu2+，Zn2+形成穩(wěn)定的復(fù)合物。研究還發(fā)現(xiàn)，固定在凝膠上的金屬離子Cu2+或Zn2+可與蛋白質(zhì)表面裸露有咪唑基或巰基的氨基酸殘基結(jié)合。因此，含有金屬離子Cu2+或Zn2+的凝膠可用來(lái)選擇性吸附表面含有組氨酸或半胱氨酸的多肽或蛋白質(zhì)。

1961年，Hellferich提出以固定于載體的金屬離子來(lái)分離小分子的概念，稱為配基交換層析(ligand exchange chromatography，LEC)[94，95]。

1975年，Poroth首次提出“固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-Chelated Affinity Chromatography，IMAC)”的概念[72]，首次成功地在瓊脂糖凝膠上偶聯(lián)了螯合配基亞氨基二乙酸(IDA)。IDA與金屬離子如Cu2+螯合后，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，不同組成的蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合力不同，據(jù)此將蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。最常用的金屬離子包括Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等過(guò)渡態(tài)金屬離子。不同蛋白質(zhì)分子內(nèi)的組氨酸、半胱氨酸以及色氨酸等殘基種類、數(shù)量、位置和空間構(gòu)象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化。

1987年，Hochuli等[96]在目標(biāo)蛋白質(zhì)末端接上六聚組氨酸多肽得到純化的重組蛋白質(zhì)。此后六個(gè)組氨酸標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于重組蛋白質(zhì)的純化。近年來(lái)，原核生物表達(dá)的重組蛋白質(zhì)已有50%以上都是通過(guò)末端接有六聚組氨酸多肽而被純化出來(lái)[97]。

目前，固定化金屬螯合親和層析技術(shù)已成為蛋白質(zhì)，特別是基因重組蛋白和多肽分離純化最有效的工具之一。

2）金屬螯合親和層析作用原理

固定化金屬螯合親和層析基于蛋白質(zhì)表面氨基酸與固定化金屬離子的親和力不同對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。金屬螯合親和介質(zhì)與蛋白質(zhì)的作用如圖2.1所示。過(guò)渡態(tài)金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結(jié)合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點(diǎn)，在溶液中被水分子或陰離子占據(jù)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面氨基酸殘基與金屬離子的結(jié)合力較強(qiáng)時(shí)，氨基酸殘基的供電原子(如組氨酸殘基的N原子、半胱氨酸殘基的S原子)將取代與金屬離子結(jié)合的水分子或陰離子，與金屬離子形成復(fù)合物，從而使蛋白質(zhì)分子結(jié)合在固相介質(zhì)表面。氨基酸中的α-氨基和α-羧基，以及某些氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)含有孤對(duì)電子的活性原子都能參與螯合反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)表面這些氨基酸的種類、數(shù)量、位置和空間構(gòu)象不同，因而與金屬配基的親和力大小不同，從而可選擇性地加以分離純化[98]。

圖2.1 金屬螯合親和介質(zhì)與蛋白質(zhì)的作用

生物分子與金屬離子間的結(jié)合強(qiáng)度與它們的軌道重疊程度有關(guān)，結(jié)合作用可分為三種[99-100]：

（1）靜電吸引：修飾后的基質(zhì)帶有凈負(fù)電荷，它可吸附分離表面氨基酸殘基帶正電荷的蛋白質(zhì)。

（2）配位鍵結(jié)合：蛋白質(zhì)表面的組氨酸、色氨酸、半胱氨酸等殘基上有咪唑基、吲哚基、巰基等，其氮原子、硫原子上未共用電子對(duì)與固定化金屬離子形成配位鍵。

（3）共價(jià)鍵結(jié)合：固定化金屬離子與蛋白質(zhì)表面含硫基團(tuán)作用形成共價(jià)鍵。

蛋白質(zhì)與金屬離子親和力不同可用Pearson的軟硬酸堿理論來(lái)解釋[101]。該理論認(rèn)為兩個(gè)原子相互作用成鍵時(shí)，其中一個(gè)原子作為路易斯酸，另一個(gè)作為路易斯堿。根據(jù)軟硬酸堿理論，金屬離子如K+、Ca2+、Mg2+、Fe3+屬于硬酸；單價(jià)金屬離子如Ag+、Cu+歸類為軟酸；過(guò)渡態(tài)金屬離子如Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+屬于中間酸。相應(yīng)的，與金屬離子結(jié)合的配基如氨基酸或蛋白質(zhì)可分為三類堿，其中含氧原子(如羧基)、脂肪族的氮原子(如天冬氨酸和谷氨酸)和磷原子(如磷酸化的氨基酸)的配基屬于硬堿；含硫原子(如半胱氨酸)的配基屬于軟堿；含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的配基屬于中間堿。中間酸Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+可與含芳香族氮原子(如組氨酸、色氨酸)的中間堿以及半胱氨酸結(jié)合。由于蛋白質(zhì)表面裸露氨基酸中半胱氨酸極少，因此組氨酸殘基是與過(guò)渡態(tài)金屬離子結(jié)合的主要基團(tuán)[102]。

六聚組氨酸融合蛋白在金屬螯合親和層析介質(zhì)表面結(jié)合和解離流程如下：

（1）將螯合配基以共價(jià)結(jié)合的方式固定在固相載體上。

（2）加入含有金屬離子如Co2+、Ni2+的溶液，金屬離子會(huì)與螯合配基形成配位鍵而固定在固相載體上。

（3）加入含有六聚組氨酸融合蛋白的溶液或發(fā)酵液，使六聚組氨酸融合蛋白與金屬離子間以配位鍵方式結(jié)合在固相載體上，而與金屬離子沒(méi)有作用力的蛋白被分離出去。

（4）洗脫結(jié)合在固相載體上的六聚組氨酸融合蛋白。對(duì)金屬螯合親和層析介質(zhì)上所結(jié)合的六聚組氨酸融合蛋白常用pH值(pH 4～5)或含咪唑的溶液進(jìn)行洗脫，低pH可減弱蛋白和金屬離子的相互作用，使六聚組氨酸融合蛋白得以洗脫，而咪唑是競(jìng)爭(zhēng)性取代劑，可置換結(jié)合在介質(zhì)上的六聚組氨酸融合蛋白，較低的pH和咪唑互相配合可更好地使六聚組氨酸融合蛋白被洗脫[103]。

3）金屬離子的選擇

金屬離子的配位數(shù)直接影響其與螯合配基及生物分子的結(jié)合，配位數(shù)既要保證能與螯合配基形成穩(wěn)定的化合物，又要保證有剩余的位點(diǎn)與目標(biāo)蛋白的氨基酸殘基結(jié)合。由于金屬離子所帶電荷、離子半徑等不同，對(duì)蛋白質(zhì)呈現(xiàn)不同親和力，目前常用金屬離子有Cu2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等，它們具有相同電荷，離子半徑分別為69、72、74和74pm。半徑越小，配位作用越強(qiáng)，與蛋白質(zhì)形成的絡(luò)合物越穩(wěn)定。因此，Cu2+對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合力最強(qiáng)，Ni2+次之，Co2+和Zn2+結(jié)合相對(duì)較弱[104]。

4）金屬螯合親和層析用于生物分離純化

篇4

[中圖分類號(hào)]R714.21 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（c）-0101-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between the dynamic changes of β-HCG， P， sHLA-G and pregnancy outcome. Methods Patients with threatened abortion and tocolytic treatment in Changsha Maternal and Child Health Care Hospital （"our hospital" for short） from July to December 2015 were selected as experimental objects. During the course of treatment， 34 cases of spontaneous abortion were set as abortion group， and 106 cases of pregnancy were set as pregnancy group. At the same time， 50 cases of pregnancy women for regular routine inspection in our hospital were selected as control group. Serum sHLA-G changes were measured quantitatively by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） at 5 to 10 weeks of gestation. Serum β-HCG and P Levels were detected by chemiluminescence method. Results Serum sHLA-G levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum sHLA-G levels of pregnant women from 5 to 10 weeks in abortion group and pregnancy group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women at 7， 8， 10 weeks between control group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum β-HCG levels of pregnant women from 7 to 10 weeks between abortion group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 5 to 10 weeks among three groups were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 7 to 8 weeks between control group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Serum P levels of pregnant women from 7 to 10 weeks between abortion group and pregnant group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion sHLA-G combined with β-HCG and progesterone as the preadictors of threatened abortion outcome can improve the accuracy of prediction and reduce unnecessary treatment， it is spefic for sHLA-G to distinguish the pregnancy outcome of threatened abortion in early pregnancy of 5， 6 weeks.

[Key words] Threatened abortion； sHLA-G； Outcome prediction

先兆流產(chǎn)是孕期常見(jiàn)的臨床病癥之一，占全部妊娠的10%～15%[1]。妊娠早期通過(guò)檢測(cè)相關(guān)因子來(lái)預(yù)測(cè)其發(fā)展為不良妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，可減少不必要的保胎治療，減輕患者心理負(fù)擔(dān)。大量研究顯示，先兆流產(chǎn)患者體內(nèi)β血清人絨毛膜促性腺激素（β-HCG）、孕激素（P）、血清可溶性人類白細(xì)胞抗原G（sHLA-G）水平會(huì)發(fā)生變化[2-4]，本文通過(guò)聯(lián)合動(dòng)態(tài)檢測(cè)β-HCG、P、sHLA-G變化來(lái)研究其對(duì)先兆流產(chǎn)結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7～12月就診于長(zhǎng)沙市婦幼保健院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）并要求保胎的先兆流產(chǎn)患者140例，年齡20～35歲，平均年齡（24±5）歲，孕齡5～8周，平均（6.56±1.60）周。治療過(guò)程中自然流產(chǎn)者34例設(shè)為流產(chǎn)組；繼續(xù)妊娠者106例為妊娠組；選擇同期在我院定期常規(guī)產(chǎn)檢的50例正常妊娠孕婦為對(duì)照組，年齡20～35歲，平均（23±4）歲，孕齡5～12周，平均（6.83±1.50）周。三組孕婦的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。孕齡的確定依照孕婦的末次月經(jīng)及經(jīng)陰道超聲測(cè)胎兒頭臀長(zhǎng)度計(jì)算。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①病史：停經(jīng)5～12周。②癥狀：血性白帶甚至陰道流血，數(shù)小時(shí)至數(shù)天后有或無(wú)下腹脹痛、腰骶部墜痛、酸脹等不適。③婦科體征：宮頸口閉合、未見(jiàn)妊娠物排出，子宮大小與孕婦停經(jīng)周數(shù)相符合。④輔助檢查：B超示子宮內(nèi)見(jiàn)孕囊，有或無(wú)胚胎存及心臟搏動(dòng)；尿妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①雙胎；②保胎治愈組患者孕12周內(nèi)再次出現(xiàn)先兆流產(chǎn)癥狀或住院期間孕齡6～10周血sHLA-G、P、β-HCG值未連續(xù)監(jiān)測(cè)者；③入院后未經(jīng)治療即明確診斷為不良妊娠者；④排除夫妻雙方染色體異常、孕婦糖尿病等慢性疾病及免疫性、解剖及感染性因素。

1.4 研究方法

1.4.1 儀器及方法 治療前及治療期間每4天分別抽取兩管靜脈血，每管4 mL，4000 r/min離心，留置血清，一管置于2～8℃冰箱中保存，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)β-HCG及孕酮水平，另一管置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存至檢測(cè)，采用雙抗體夾心法檢測(cè)sHLA-G，試劑盒來(lái)自上海史瑞可生物有限公司；采用酶標(biāo)儀（美國(guó)550型BIO-RAD）測(cè)定吸光度，波長(zhǎng)為450 nm，所測(cè)為血清總sHLA-G水平。

1.4.2 治療方案 HCG 2000 IU肌內(nèi)注射，一日兩次，黃體酮20 mg肌內(nèi)注射，一日一次，至陰道流血停止3 d后為止。治療期間B超確診為胚胎停育或流產(chǎn)者終止保胎治療。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組孕婦不同孕齡時(shí)間血清sHLA-G水平比較

三組孕婦孕5～10周血清sHLA-G水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；對(duì)照組與妊娠組孕5～10周血清sHLA-G水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；流產(chǎn)組與妊娠組孕5～10周血清sHLA-G水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；三組孕婦血清sHLA-G的95%參考值范圍不同，且不存在交叉范圍。見(jiàn)表1。

2.2 三組孕婦不同孕g(shù)時(shí)間血清β-HCG水平比較

三組孕婦孕5～10周血清β-HCG水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；對(duì)照組與妊娠組孕7、8、10周血清β-HCG水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；流產(chǎn)組與妊娠組孕7～10周血β-HCG水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 三組孕婦不同孕齡時(shí)間血清孕酮水平比較

三組孕婦孕5～10周血清孕酮水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；對(duì)照組與妊娠組孕7～8周血清孕酮水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；流產(chǎn)組與妊娠組孕7～10周血清孕酮水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表3。

篇5

對(duì)此，荷寶基金首席分析師陸敏在接受《中國(guó)聯(lián)合商報(bào)》記者采訪時(shí)分析：“這意味著上海白貓股份，已經(jīng)站在了生與死的十字路口。他們目前只有或者重組成功或者暫停上市甚至退市兩種選擇?！?/p>

難解的虧損困惑

根據(jù)上海白貓股份年報(bào)披露的數(shù)據(jù)，上海白貓股份2008年實(shí)現(xiàn)主營(yíng)業(yè)務(wù)收入34895.31萬(wàn)元，同比略升1.18％；受外部環(huán)境影響，實(shí)現(xiàn)主營(yíng)業(yè)務(wù)利潤(rùn)2709.51萬(wàn)元，同比下降28.31%?？鄢N售費(fèi)用近5000萬(wàn)元、管理費(fèi)用3400多萬(wàn)元、財(cái)務(wù)費(fèi)用300多萬(wàn)元等，白貓的凈利潤(rùn)為-3500多萬(wàn)元，每股收益為-0.234元。

“大家都在把虧損歸咎于去年爆發(fā)的金融危機(jī)，可我們?cè)趪?guó)際貿(mào)易上是贏利的，不知問(wèn)題到底出在哪了。”上海白貓股份國(guó)際貿(mào)易部一負(fù)責(zé)人，在接受《中國(guó)聯(lián)合商報(bào)》記者采訪時(shí)說(shuō)道。

對(duì)此，上海白貓股份董事長(zhǎng)辦公室一負(fù)責(zé)人陸梅向《中國(guó)聯(lián)合商報(bào)》記者進(jìn)行了解釋：“我們?cè)谌ツ甑耐赓Q(mào)銷售收入同比上升了24.78％，但受人民幣匯率上升的影響，銷售利潤(rùn)卻同比減少1224.21萬(wàn)元；再加上前年下半年國(guó)家開始調(diào)整牙膏出口退稅率，也使我們外貿(mào)銷售利潤(rùn)同比減少539.97萬(wàn)元。”

“這些都是大家共同面臨的外部大環(huán)境，白貓股份之所以連年出現(xiàn)虧損。我認(rèn)為最重要的是在國(guó)內(nèi)牙膏產(chǎn)品銷售異常激烈的情況下，白貓股份由于重組不暢導(dǎo)致投入不足，以致影響了它的市場(chǎng)營(yíng)銷和拓展進(jìn)度?！敝型蹲C券上海營(yíng)業(yè)部投資經(jīng)理戴克江向《中國(guó)聯(lián)合商報(bào)》記者如此表示。

一波三折的重組

對(duì)于上海白貓股份的處境。業(yè)內(nèi)人士分析，必須依靠大股東的力量才能走出來(lái)。但在事關(guān)重組的大問(wèn)題上，上海白貓股份的大股東浙江新洲集團(tuán)的表現(xiàn)讓人很是摸不透。“我們的管理層也一直在積極配合、督促大股東推進(jìn)資產(chǎn)重組工作，可自從去年4月28日出臺(tái)了一個(gè)重組方案后就一直進(jìn)展不順。現(xiàn)在更是沒(méi)有任何動(dòng)靜和進(jìn)展?！标懨穾c(diǎn)抱怨的口氣向《中國(guó)聯(lián)合商報(bào)》記者說(shuō)。

根據(jù)陸梅的說(shuō)法，在2008年4月28日和5月9日，他們?cè)?lián)合第一大股東新洲集團(tuán)對(duì)上海白貓股份做了一個(gè)重大資產(chǎn)重組的公告。公告的大體內(nèi)容是新洲集團(tuán)將下屬房地產(chǎn)公司股權(quán)與白貓股份的全部資產(chǎn)、負(fù)債進(jìn)行置換，置換完成后，白貓股份轉(zhuǎn)型為房地產(chǎn)開發(fā)企業(yè)。

而在《中國(guó)聯(lián)合商報(bào)》記者致電新洲集團(tuán)總裁辦公室詢問(wèn)時(shí)。一個(gè)姓王的負(fù)責(zé)人也表示：“現(xiàn)在還沒(méi)有任何關(guān)于重組這方面的新消息。具體的部署也還沒(méi)聽說(shuō)?！辈贿^(guò)談起這個(gè)重組方案姓王的負(fù)責(zé)人承認(rèn)有這個(gè)事。“為了此次資產(chǎn)置換，我們還在上海普陀區(qū)全資設(shè)立了上海威順投資管理有限公司，用于購(gòu)買新洲集團(tuán)擁有上海白貓股份的股權(quán)，再將白貓股份全部資產(chǎn)和負(fù)債劃進(jìn)來(lái)?！?/p>

新洲集團(tuán)在當(dāng)時(shí)也承諾，“在注入兩家地產(chǎn)公司進(jìn)入白貓股份后，新洲集團(tuán)將不再?gòu)氖滦碌姆康禺a(chǎn)業(yè)務(wù)以解決同業(yè)競(jìng)爭(zhēng)的問(wèn)題?！?/p>

沒(méi)有選擇的選擇

那么面對(duì)連年虧損和重組的緩慢，上海白貓股份到底是選擇重組成功還是暫停上市甚至退市，恐怕已經(jīng)沒(méi)有多少時(shí)間來(lái)進(jìn)行思考了。

“上海白貓股份是國(guó)企，在日用領(lǐng)域尤其是牙膏方面是中國(guó)的一面旗幟。因此是不可能輕易退市的。剩下的就只有一條路可選了那就是重組?！标懨粝颉吨袊?guó)聯(lián)合商報(bào)》記者解釋。

事實(shí)上，這幾年上海白貓股份也一直為避免退市而掙扎著。如在2005年白貓股份在凈利潤(rùn)為-701萬(wàn)元的情況下，才引入了新洲集團(tuán)。

對(duì)此說(shuō)法，王立欣表示認(rèn)同?！爱?dāng)然如果能夠扭虧為盈更好了。但截止上海白貓股份到今天的表現(xiàn)，這種可能性的發(fā)生有很大的難度?！?/p>

相關(guān)資料也顯示，此前的2007年，白貓股份虧損了925.2萬(wàn)元。而今年則是3500萬(wàn)元。顯然，白貓股份的經(jīng)營(yíng)情況非但沒(méi)有好轉(zhuǎn)，而且呈現(xiàn)出加速滑向泥潭的趨勢(shì)。然而，白貓股份的資產(chǎn)置換方案至今尚無(wú)明顯的進(jìn)展。

“我認(rèn)為不排除改變把上海白貓股份變?yōu)榉康禺a(chǎn)公司的重組計(jì)劃，畢竟作為上海白貓的第一大股東，新洲集團(tuán)此前一直沒(méi)有過(guò)經(jīng)營(yíng)日化行業(yè)的背景，而且從新洲集團(tuán)進(jìn)入上海白貓股份的作為看，也并沒(méi)止住上海白貓股份繼續(xù)下滑的勢(shì)頭?！贝骺私颉吨袊?guó)聯(lián)合商報(bào)》記者分析。

篇6

比如李嘉誠(chéng)在內(nèi)地保健品領(lǐng)域，就擁有不小的話語(yǔ)權(quán)。

羊胎素、有機(jī)奶粉、專供孕婦食用的 DHA產(chǎn)品，以及某些內(nèi)地學(xué)生逢大考前常常吃的保健品，都有李嘉誠(chéng)的產(chǎn)業(yè)。準(zhǔn)確地說(shuō)，這些產(chǎn)業(yè)都?xì)w攏在和記黃埔旗下的和黃健寶保健品有限公司，這家公司成立已超過(guò)10年。

求醫(yī)問(wèn)藥時(shí)，有些常用藥，比如板藍(lán)根顆粒、復(fù)方丹參片，也有李嘉誠(chéng)的影子。

和記黃埔旗下有專門的醫(yī)藥科技公司，在醫(yī)藥行業(yè)是不折不扣的“隱形大戶”，勢(shì)力覆蓋“北上廣”李嘉誠(chéng)在北京與同仁堂合作，在上海開辦有上海和黃醫(yī)藥有限公司，在廣州與白云山醫(yī)藥合資建廠。

2004年時(shí)，李嘉誠(chéng)明確定調(diào)：中藥將是和記黃埔的第六大支柱產(chǎn)業(yè)。緊跟著在2006年，李嘉誠(chéng)就將他的醫(yī)藥公司名單，掛上了歐洲的倫敦交易所，成了筆跨國(guó)大生意。 2011年5月20日，香港，李嘉誠(chéng)在公司股東會(huì)后出席新聞會(huì)。

另外一個(gè)巨頭雀巢公司就看中了李嘉誠(chéng)在中藥產(chǎn)業(yè)上的判斷，更看中李嘉誠(chéng)在中藥行業(yè)隱秘深耕多年的家底：和記黃埔的中藥材庫(kù)十分巨大，包括1200多種藥用植物的5萬(wàn)種提取物。去年年底，雀巢第一次涉足中藥產(chǎn)業(yè)在此之前，這家瑞士公司也確實(shí)在嘗試做一些實(shí)驗(yàn)，比如在嬰兒米粉中加入綠豆和蓮子，讓產(chǎn)品能“去火”。

雀巢現(xiàn)在與李嘉誠(chéng)合伙開辦了一家公司，希望可以找到用中藥治療腸胃病的辦法。

總之，熱衷于進(jìn)入醫(yī)藥行業(yè)，這一點(diǎn)李嘉誠(chéng)與比爾·蓋茨的投資興趣很像。

除此之外，一個(gè)日化品牌白貓洗潔精，從2006年開始，就已經(jīng)是李嘉誠(chéng)的無(wú)形資產(chǎn)。2006年和記黃埔收購(gòu)了白貓集團(tuán)所持有的上海白貓有限公司80%的股份，共同組建上海和黃白貓有限公司，也就是“和黃白貓”。2009年4月，白貓集團(tuán)又將“白貓”商標(biāo)轉(zhuǎn)給和黃白貓，所以在市場(chǎng)上看到的“白貓”洗滌產(chǎn)品，已經(jīng)蓋上了李嘉誠(chéng)的烙印。

需要說(shuō)明的是，“白貓”其實(shí)有兩個(gè)，另一個(gè)“白貓”是白貓股份，是一家經(jīng)營(yíng)不善的上市公司，2010年已退市。其間兩只“白貓”烏龍不斷，引得和記黃埔的新聞發(fā)言人要不時(shí)澄清：這只白貓和李嘉誠(chéng)沒(méi)關(guān)系。

李嘉誠(chéng)在另一個(gè)時(shí)髦領(lǐng)域互聯(lián)網(wǎng)、IT行業(yè)的投資令人感覺(jué)距離感更小。

他投過(guò)facebook、skype，以及后來(lái)被蘋果公司買走的語(yǔ)音助手軟件Siri。投facebook的決策時(shí)間只花了五分鐘，而當(dāng)時(shí)的facebook尚未營(yíng)收。五年間，他手中所持的3%股權(quán)，回報(bào)率高達(dá)580%，據(jù)估計(jì)，他能從中賺得20多億美元。李嘉誠(chéng)卻表示，在自己投資的新科技公司中，facebook賺得未必最多。

為他物色高科技企業(yè)的公司叫維港投資，專注于中早期科技類項(xiàng)目其操盤者正是五分鐘內(nèi)說(shuō)服李投facebook的周凱旋。據(jù)《經(jīng)濟(jì)觀察報(bào)》報(bào)道，維港投資團(tuán)隊(duì)成員只有四名，一貫低調(diào)，沒(méi)有官方網(wǎng)站，卻能憑其遍布全球的團(tuán)隊(duì)，挖掘出一般人不易察覺(jué)的項(xiàng)目。

再往近了說(shuō)，我們的“衣食住行”，也有“李嘉誠(chéng)牌?！比A南地區(qū)能吃到的東北大米，會(huì)有一部分來(lái)自和記黃埔在黑龍江的生產(chǎn)基地。《證券時(shí)報(bào)》曾經(jīng)報(bào)道說(shuō)，在中國(guó)入世前，李嘉誠(chéng)受邀到黑龍江投資稻米，并于1998年成立合資企業(yè)，開發(fā)近150萬(wàn)平方公里產(chǎn)糧地。

篇7

1998年，埃米爾·庫(kù)斯圖里卡導(dǎo)演的作品《黑貓白貓》一經(jīng)推出便備受矚目。似乎總是不修邊幅的人物形象，粗糲而又充滿想象力的畫面，濃烈的影像色彩，鋪天蓋地的戲謔、玩笑、嘲弄和尋歡作樂(lè)，毫不吝嗇的語(yǔ)言對(duì)白，此起彼伏的喧鬧場(chǎng)景，喜劇化的故事結(jié)局——在這些庫(kù)氏影片的慣?！鞍d狂笑鬧”影像風(fēng)格背后，也隱藏著庫(kù)斯圖里卡慣常的某些觀念和情愫。而對(duì)該片不同年齡層人群的劃分和形象設(shè)定的解讀分析，正是我們深入探尋導(dǎo)演觀念和情愫的最佳途徑。

一

《黑貓白貓》片中的人群，可以按照年齡層劃分為三個(gè)明顯的人群——老人、孩子和中年人。每一個(gè)年齡層人群，總有著對(duì)應(yīng)的人物性格和形象。

電影中的兩個(gè)老頭子：吉普賽黑幫教父格加和他的老友扎吉，還有個(gè)吉普賽大媽，性格是如此地相像——和藹開明、關(guān)愛(ài)孫輩、而又有些孩子氣的老頑童。

格加最喜歡重復(fù)觀看《卡薩布蘭卡》的結(jié)局部分，并重復(fù)那句經(jīng)典的臺(tái)詞“路易，我想這是一段美好友誼的開始”。在影片最后，看著扎吉的孫子扎拉和愛(ài)人艾達(dá)在多瑙河上完成婚禮并登上游船后，他和扎拉一邊干杯一邊再次念出這句臺(tái)詞——和閣樓上這兩位老友被“死后”冰封又同時(shí)“復(fù)活”的奇妙經(jīng)歷結(jié)合起來(lái)，這句經(jīng)典臺(tái)詞和他們手中的美酒，真正成為兩人幾十年友誼的最佳象征。

在家庭內(nèi)部，這三位老人最為關(guān)心的就是自己的孫輩。格加一次又一次勸說(shuō)長(zhǎng)孫葛爾加結(jié)婚。扎吉為了孫子特意把所有積蓄都藏在手風(fēng)琴里并最終念念不忘地親手交給了他，甚至愿意以自我犧牲來(lái)阻止孫子將要被迫進(jìn)行的不幸婚禮。艾達(dá)的吉普賽祖母從一開始想把孫女艾達(dá)賣給黑幫頭子達(dá)旦做老婆，到后來(lái)接受了孫女對(duì)愛(ài)情的選擇。三位老人對(duì)于家庭后代的關(guān)愛(ài)，與后面將要提到的中年人一代形成了諷刺性的鮮明對(duì)比。

影片中的幾個(gè)孩子——扎拉、艾達(dá)、葛爾加以及達(dá)旦的妹妹“小瓢蟲”，都是執(zhí)拗而可愛(ài)的，都有著對(duì)愛(ài)情的堅(jiān)持。他們身上所展現(xiàn)的正是青春的張揚(yáng)和對(duì)愛(ài)情的忠貞。經(jīng)過(guò)掙扎、反抗與堅(jiān)持，扎拉和艾達(dá)、葛爾加和“小瓢蟲”這兩對(duì)有情人終成眷屬，這是庫(kù)斯圖里卡對(duì)于這種青春的真善美的肯定和贊美。

反觀影片中的中年人一代，其代表就是財(cái)迷心竅、膽小懦弱的馬考以及其暴戾蠻橫、欺軟怕硬的“好友”——自稱“商人和愛(ài)國(guó)者”的黑幫匪徒頭子達(dá)旦，以及那個(gè)道貌岸然的政府證婚官員。

馬考一直覬覦父親的工廠和財(cái)產(chǎn)，并且妄想通過(guò)侵吞國(guó)家物資來(lái)大發(fā)不義之財(cái)；而流氓成性的達(dá)旦則對(duì)“好友”馬考的發(fā)財(cái)計(jì)劃來(lái)了個(gè)殺人吞贓，甚至對(duì)馬考一頓毒打。為了金錢利益，他們合計(jì)著分別出賣了自己的兒子和妹妹的婚姻幸福。由于格加和扎吉兩位長(zhǎng)輩先后突然“猝死”會(huì)打斷婚禮，兩人不顧一切地將兩位老人的“尸身”冰凍起來(lái)--從這對(duì)中年“老友”身上，觀眾只能看到荒誕不經(jīng)、財(cái)迷心竅、爾虞我詐以及對(duì)家庭成員的漠視和利用。和他們長(zhǎng)輩的交情相比，他們之間的“友情”是何其的荒誕與諷刺。

而那位西裝革履的證婚官員，他摔開的皮箱里除了文件外還赫然滾落出各種吸毒工具——癮君子的事實(shí)將他冠冕堂皇的臉皮在眾人面前瞬間揭穿。而為了保住顏面，他居然還向同為癮君子的達(dá)旦結(jié)結(jié)巴巴地辯解和哀求。這種戲劇化效果帶來(lái)的諷刺真可謂酣暢淋漓。

二

通過(guò)對(duì)人物群體的劃分，片中老人、孩子和中年人這三組人群迥異的形象得以分別展現(xiàn)。而導(dǎo)演如此劃分人群并設(shè)定群體形象的動(dòng)機(jī)，就需要進(jìn)一步解讀了。

從庫(kù)斯圖里卡的電影作品特征來(lái)看，狂歡、家庭、鄉(xiāng)愁、音樂(lè)、黑色幽默和政治諷喻這幾大元素可謂旗幟鮮明。尤其是政治諷喻這一重要元素，在其青年時(shí)代的電影創(chuàng)作中就已初現(xiàn)端倪。而在他被迫遠(yuǎn)離南斯拉夫長(zhǎng)期旅居西歐的二十世紀(jì)九十年代期間，南斯拉夫已經(jīng)處在戰(zhàn)亂頻繁、分崩離析的階段。庫(kù)斯圖里卡電影作品中的鄉(xiāng)愁和政治諷喻元素，在無(wú)形中產(chǎn)生融合并顯得更為濃重。如果說(shuō)1995年推出的《地下》淋漓盡致地展現(xiàn)了這種融合的話，那么《黑貓白貓》則是在另外一種視角的小范圍故事框架內(nèi)，含蓄地將這種融合潛藏了起來(lái)。這些因素便是對(duì)本片群體形象進(jìn)行解讀的關(guān)鍵癥結(jié)所在。

從二戰(zhàn)爆發(fā)到整個(gè)冷戰(zhàn)時(shí)期的幾十年時(shí)間里，無(wú)論是面對(duì)納粹德國(guó)還是蘇聯(lián)，南斯拉夫一直是一個(gè)敢于抗?fàn)?、從不屈服的?guó)家。而《黑貓白貓》中所塑造的年輕人群體形象，同樣是勇于堅(jiān)持、敢于抗?fàn)幍?，這可以視作是南斯拉夫幾十年來(lái)國(guó)家不屈形象的人形化表現(xiàn)。通過(guò)對(duì)影片中年輕人們最終爭(zhēng)取到自由和幸福命運(yùn)的歌頌與贊美，庫(kù)斯圖里卡也完成了對(duì)故國(guó)南斯拉夫的致敬。

對(duì)于影片中的老人群體，庫(kù)斯圖里卡對(duì)他們也持著一種肯定和贊美的態(tài)度。他們對(duì)孫輩的關(guān)愛(ài)和付出、甚至是自我犧牲，其實(shí)也象征著真正的愛(ài)國(guó)者對(duì)于南斯拉夫這個(gè)國(guó)家的真正關(guān)愛(ài)--不僅是關(guān)心孩子和國(guó)家的現(xiàn)在，也關(guān)心孩子和國(guó)家的未來(lái)。作為一個(gè)電影藝術(shù)家，庫(kù)斯圖里卡多少也把自己對(duì)故國(guó)南斯拉夫的熱愛(ài)之情，通過(guò)片中老人們這個(gè)群體加以抒發(fā)。

相對(duì)的，影片中的中年人形象也是庫(kù)斯圖里卡用意最深的部分——這些財(cái)迷心竅、好賭濫飲、道貌岸然的投機(jī)犯、癮君子和偽君子們，他們本應(yīng)是家庭的主心骨、國(guó)家的中堅(jiān)力量。但是在影片中，他們的形象卻是如此不堪入目?？梢哉f(shuō)，庫(kù)斯圖里卡所塑造的這些中年人的形象，正反映了他對(duì)于搞垮南斯拉夫的那批蛀蟲的痛恨和不齒。如此塑造這兩個(gè)中年人的形象，就是對(duì)造成南斯拉夫動(dòng)亂分裂的那些罪魁禍?zhǔn)椎囊环N諷喻。

同時(shí)我們也可以發(fā)現(xiàn)，影片中的老人群體對(duì)這些中年人群體往往持有一種懷疑甚至是厭惡的態(tài)度——扎吉更喜歡懂事的孫子扎加而不是兒子馬考，格加并不待見(jiàn)上門借錢的馬考并拔槍警告他，格加面對(duì)達(dá)旦時(shí)的那種輕蔑態(tài)度……可以說(shuō)導(dǎo)演借助片中老人群體對(duì)中年人群體態(tài)度的設(shè)定，抒發(fā)著自身對(duì)于片中中年人群體所象征的現(xiàn)實(shí)人群的憎惡情感。

篇8

話劇開始了，出現(xiàn)了獨(dú)眼狼、單眼狼，他們被關(guān)進(jìn)大牢里，外面有很多士兵守衛(wèi)。就在這個(gè)時(shí)候，臭狐貍代表大灰狼來(lái)看他們。它手里拿著一盒曲奇餅干，說(shuō)：“我特意代表大灰狼來(lái)看你們了，這盒餅干是我們的一點(diǎn)心意。當(dāng)年大灰狼和你們一起坐牢，可是被一場(chǎng)海嘯分開了，這次我們找到了你們，特意送來(lái)餅干，表示一點(diǎn)心意……”

狐貍走了，衛(wèi)兵也走了。獨(dú)眼狼和單眼狼食偷偷地把曲奇餅干盒打開，他們發(fā)現(xiàn)盒子里面有一個(gè)紙條和一把萬(wàn)能鑰匙，他們說(shuō)：“這一定是大狼給我們的。”然后他們說(shuō)，這兩天一定會(huì)來(lái)一場(chǎng)大大的雷陣雨，所以要它們趁雷陣雨和霧氣很大時(shí)把門偷偷打開，逃出去。

當(dāng)然，這個(gè)計(jì)劃成功了。半路上，突然聽到黑貓警長(zhǎng)的聲音，他們拼命的逃，逃到了一家超市店門口，因?yàn)榻裉煊欣子?，超市提前關(guān)門。他們突然想起自己手中有一把萬(wàn)能鑰匙，他們就用萬(wàn)能鑰匙把門打開，進(jìn)入超市偷走了很多東西，把肚子也填飽飽的了。

可當(dāng)出來(lái)的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)黑貓警長(zhǎng)把他們包圍了。這時(shí)，大狼和狐貍從四周殺來(lái)救他們，于時(shí)他們沖出了包圍。壞蛋們一起逃啊逃啊，突然發(fā)現(xiàn)黑貓警長(zhǎng)在前面攔住了他們，白貓警長(zhǎng)和小鹿警官在后面攔住了他們，使他們無(wú)路可逃，又被關(guān)進(jìn)了大牢。

篇9

這三節(jié)課的共同點(diǎn)是：

一、基本上都落實(shí)了學(xué)講計(jì)劃的精神，先學(xué)后教，給足了學(xué)生自主學(xué)習(xí)的時(shí)間，整個(gè)教學(xué)過(guò)程中滲透了學(xué)生的自學(xué)、互學(xué)，教學(xué)的痕跡。突出了學(xué)生的主體地位，教師退到了后面，給足了學(xué)生充分展示自己的機(jī)會(huì)，教師主要發(fā)揮四兩撥千斤的作用。

二、課堂教學(xué)有重點(diǎn)突出，教師對(duì)于教材的解讀深刻，有新意，教學(xué)程序設(shè)計(jì)巧妙，環(huán)環(huán)相扣，條理清晰。教學(xué)過(guò)程中，重視對(duì)學(xué)生的朗讀訓(xùn)練，形式多樣，教師指導(dǎo)到位。

三、教師教態(tài)自然大方，在上課前都注重課堂管理，采用交談，夸贊、鼓勵(lì)性的話語(yǔ)拉近與學(xué)生的距離，讓學(xué)生入情入境，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性，課堂氣氛活躍。在教學(xué)過(guò)程中，教師語(yǔ)言親切柔和，對(duì)學(xué)生的表現(xiàn)，評(píng)價(jià)及時(shí)中肯。

這三節(jié)課體現(xiàn)了三種不同的風(fēng)格：

第一節(jié)宋穎老師執(zhí)教的《桂花雨》，就如宋老師給人的春風(fēng)化雨般的感覺(jué)一樣，溫柔舒適，親切柔和，真有如沐春風(fēng)般的感覺(jué)。尤其是指導(dǎo)朗讀很有特色，善于創(chuàng)設(shè)情景讓學(xué)生入情入境。在指導(dǎo)朗讀贊美桂花之香時(shí)，創(chuàng)設(shè)了四種情景讓學(xué)生讀，當(dāng)桂花落在額頭、鼻尖、衣袖、全身不同的情況下對(duì)桂花的贊美。再如理解"纏"時(shí)，又創(chuàng)設(shè)了一天之內(nèi)的不同時(shí)間"纏"著媽媽問(wèn)啥時(shí)搖桂花的情景，讓學(xué)生朗讀體會(huì)。最動(dòng)情的地方是配樂(lè)朗讀和電影般的情景再現(xiàn)似回讀。宋老師選的配樂(lè)曲溫婉動(dòng)聽，聽了確實(shí)令人動(dòng)情，加之宋老師高超的朗誦水平，確實(shí)讓學(xué)生直接的感受到了懷念故鄉(xiāng)之情。宋老師還聯(lián)系了最后一句中懷念兒時(shí)搖桂花的情景，運(yùn)用配樂(lè)的方式回讀文章的第三節(jié)搖桂花的句子，再現(xiàn)了這一情景，真如電影回放一樣，聽這節(jié)課令人很感動(dòng)。

篇10

希望變成失望

山里到處是冰冷的空氣。但清晨的陽(yáng)光總能給人帶來(lái)一絲的希望?？墒俏覜](méi)有想到以后的路是這樣艱難。 　今天的目標(biāo)是碎石達(dá)板，不知為什么在大家的印象中翻過(guò)碎石達(dá)板就象征著即將到來(lái)的成功，剩余的路好象不再是路。

雪隨著行進(jìn)的腳步慢慢的越過(guò)腳腕，河道的冰層在太陽(yáng)的照射下閃閃發(fā)光，一個(gè)渾然的天然冰場(chǎng)!我們感嘆著。

董隊(duì)、徐姐、王志和我選擇了走山脊的路，大笨笨、飛磚、30、大臣、探路魚、長(zhǎng)白貓則選擇了河谷，我們兩隊(duì)人馬遙遙相應(yīng)的在寒風(fēng)中行進(jìn)。

河谷中依稀地出現(xiàn)了點(diǎn)點(diǎn)的帳篷，心理開始納悶這前面的也走的太快了，我們準(zhǔn)備探個(gè)虛實(shí)。還未下到一半就見(jiàn)一人揮舞著雙仗，原來(lái)是飛磚大聲高喊，隱約中只聽到博格達(dá)有暴風(fēng)雪的字樣，我的心剎時(shí)跌入了低谷之中，大家都知道暴風(fēng)雪將意味著什么。

原來(lái)在此扎營(yíng)的是另一隊(duì)人馬，昨晚已到這里，領(lǐng)隊(duì)用很有經(jīng)驗(yàn)的樣子告訴我們博格達(dá)此刻正在暴風(fēng)雪中，如果能上他們一大早就上了，這可是在拿生命開玩笑。 　當(dāng)說(shuō)到生命二字的時(shí)候大家的表情都很嚴(yán)肅，當(dāng)面臨選擇的時(shí)候又該如何取舍。就在大家迷茫地作著思想斗爭(zhēng)的時(shí)刻，董隊(duì)堅(jiān)決地說(shuō)繼續(xù)前進(jìn)能不能上我們也得走到三號(hào)羊圈看了天氣情況再定，就這樣一句簡(jiǎn)短而堅(jiān)決的話語(yǔ)重新堅(jiān)定了大家已經(jīng)快被瓦解了的信心。由于“大臣”早晨貪吃了“飛磚”的兩個(gè)雞蛋，膽囊炎發(fā)作只好跟隨另隊(duì)人馬返回之外，其余的9人又踏上了新的征途。

前方的路越發(fā)模糊，風(fēng)夾雜著地上的浮雪吹著大家紅撲撲的小臉和大臉，可是沒(méi)有一個(gè)人退縮，頂風(fēng)而上迎來(lái)的是迷霧中的碎石達(dá)坂……

去不去大本營(yíng)

小冰湖的雪比想象中的更深，惡劣的天氣迫使我們不得不在小冰湖扎營(yíng)。 　兩個(gè)小時(shí)過(guò)去了，可是我們還未走出小冰湖，道路的艱難再一次出乎每個(gè)人的意料。是否去大本營(yíng)成為大家爭(zhēng)論的焦點(diǎn)。這個(gè)時(shí)候董隊(duì)堅(jiān)持，到了以肯奇達(dá)坂的腳下再做決定。夏天從這里往返大本營(yíng)一小時(shí)的路程現(xiàn)在預(yù)計(jì)需要3小時(shí)。隊(duì)伍慢慢的向前推移，行進(jìn)的速度怎么都無(wú)法提起，12點(diǎn)我們才走到達(dá)坂腳下，這時(shí)候雪已經(jīng)漫過(guò)膝蓋，腳下的石頭被雪覆蓋了，無(wú)法預(yù)知下面的深淺和危險(xiǎn)，一不留神就會(huì)陷入石頭的夾縫中，扭傷腳腕，這是大家最最擔(dān)心又最最害怕的。去大本營(yíng)的提議已在這無(wú)聲的行走中被 PASS，今天能否走出將軍溝順利返回到海西還是個(gè)大大的問(wèn)號(hào)，敲打著每個(gè)人的心。但大家都很樂(lè)觀的預(yù)測(cè)著翻上以肯奇達(dá)板后面的路會(huì)好的。 　夏日里的以肯奇達(dá)板現(xiàn)在已成為一座白雪皚皚的雪山，此時(shí)的博格達(dá)峰異常美麗，峰頂彌漫著白色的霧氣，像在云中飄舞的仙子，大家為這美麗的景色驚嘆著。

體力漸漸的不支，可達(dá)坂的頂一眼望不到頭，上山的路越來(lái)越陡，探路魚一馬當(dāng)先的在前面沖鋒現(xiàn)陣，為大家開路，垂直距離簡(jiǎn)直無(wú)法行進(jìn)，回家的感覺(jué)變得那么迫切。如果不能用我的雙腳走上以肯奇達(dá)坂，那么我會(huì)用我的雙膝爬上去。

我陷入窘境

我們用了整整四個(gè)小時(shí)登上了在夏天一個(gè)小時(shí)就可以翻過(guò)的達(dá)坂。前途變得未知而渺茫，已經(jīng)4點(diǎn)了，想著今天不能趕回去明天的路依然未知，大家沒(méi)有―點(diǎn)點(diǎn)翻過(guò)達(dá)坂面對(duì)勝利的感覺(jué)。達(dá)坂下的路并不樂(lè)觀，雪甚至比上山的還厚，我真想卸下背包將它一腳踢下山崖，然后再把自己像個(gè)大皮球似的滾下去。夜好似也在趕路，看著漸漸下落的夕陽(yáng)，所有的希望、所有的信念在這一刻都被瓦解。我拖著沉重的雙腳機(jī)械的行走，雪套的鏈子開了，雪灌進(jìn)了鞋子，雙腳漸漸地冰涼。我已無(wú)暇顧及依舊行走，我告訴自己不能停，如果停下來(lái)我就會(huì)變成雪人留在這里，不能回家。

我想回家!

天已黑了，我的雙手已經(jīng)凍得失去了知覺(jué)，左手腫得像塊面包，右手已經(jīng)麻木。“如果不介意就把雙手放進(jìn)我的懷里，”30說(shuō)。在這個(gè)冰天雪地，前不著村后不著店的地方，我還能介意什么，在這個(gè)時(shí)刻我還能在去考慮什么，所剩的只是一面之緣的感動(dòng)。

在30溫暖的胸懷中我的手漸漸地開始恢復(fù)了一絲絲的知覺(jué)。也許大家會(huì)拿這―段來(lái)調(diào)侃，但是我一點(diǎn)都不介意，我為路途中的這些深深地感動(dòng)，那些在徒步的過(guò)程中曾經(jīng)因?yàn)楸持林氐谋嘲鼰o(wú)法自己去系敞開的鞋帶而幫你系過(guò)鞋帶的人；曾經(jīng)因?yàn)樾瑤鼋┝藷o(wú)法拖下鞋子而沒(méi)有給媽媽脫過(guò)鞋子而幫你拖下鞋子的人；曾經(jīng)因?yàn)殡p手失去知覺(jué)用自己的胸懷為你捂熱雙手的人。不是每一次都有這樣刻骨銘心的經(jīng)歷，患難見(jiàn)真情，每―次的徒步，無(wú)論多么艱難，我的心都是暖的。我對(duì)自己說(shuō)，SUMMER，你是一個(gè)堅(jiān)強(qiáng)、快樂(lè)的女孩，永遠(yuǎn)像夏天一樣燦爛的女孩，走過(guò)了今天，在今后的人生當(dāng)中還有什么過(guò)不去的檻呢，困難算什么呢，困難就是你生活中的小菜。

扎營(yíng)之后的情況并不樂(lè)觀，由于超出了計(jì)劃一天，大家都沒(méi)有留存多余的食物，四人已經(jīng)斷了口糧，氣罐的火焰也再慢慢地減弱，大家小心翼翼地計(jì)劃著晚餐，并為明天未知的前程不覺(jué)地保留了僅有的一點(diǎn)點(diǎn)食物。在這荒涼的大山中，無(wú)法和外界聯(lián)系，不能不為保持最后的體力留存一些能量。當(dāng)面臨生存考驗(yàn)的時(shí)候，人的本能可以預(yù)知一切的未知。

A、B、C三個(gè)計(jì)劃

大家在商量著明天的對(duì)策，探路負(fù)的聲音漸漸清晰。最后終于達(dá)成了 A、B、C三個(gè)計(jì)劃。

夜慢慢的靜下來(lái)，未知的路途、不夠一天的能量、即將瀕臨崩潰邊緣的精神。這一夜又是―個(gè)思緒萬(wàn)分的不眠之夜。