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篇1

[關鍵詞] 小柴胡顆粒；高效液相色譜法；指紋圖譜；質(zhì)量評價

小柴胡顆粒是根據(jù)東漢張仲景《傷寒論》中的小柴胡湯方加工制成的現(xiàn)代中成藥，是中醫(yī)和解劑的代表方，由柴胡、黃芩、黨參、甘草、姜半夏、大棗和生姜7味藥組成，具有解表散熱、疏肝和胃的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，該方還具有較好的抗炎、保肝利膽、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等作用，在臨床上應用廣泛[2-3]。小柴胡顆粒生產(chǎn)廠家眾多，質(zhì)量參差不齊，僅針對某個或幾個指標成分進行定性、定量分析并不能對其質(zhì)量進行有效地控制，而特征指紋圖譜能較全面直觀地表征出中藥復方制劑中所含化學成分的種類和數(shù)量，進而反映該制劑內(nèi)在的質(zhì)量[4]。因此本研究建立了市售小柴胡顆粒的HPLC指紋圖譜研究方法，對小柴胡顆粒中7 種主要指標性成分進行同時分析測定，并用相似度評價軟件和SPSS軟件，對其指紋圖譜的特征峰數(shù)據(jù)進行了相似度計算和系統(tǒng)聚類分析，評價了不同廠家和同廠家不同批次市售小柴胡顆粒的質(zhì)量，旨在為小柴胡顆粒的質(zhì)量評價提供一種較為全面的分析手段。

1 材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；G1311C 1260Quat四元泵（美國安捷倫）；G1329B 1260ALS進樣器（美國安捷倫）；G1314B 1260VWD VL檢測器（美國安捷倫）；Rev.B.04.03[52]液相色譜工作站（美國安捷倫）；BT 125D天平（賽多利斯）；KH5200E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

本試驗收集了11個不同廠家市售小柴胡顆粒，購自全國各地零售藥店。樣品來源和批號見表1，2。將11個廠家樣品隨機編號，依次記為S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，S11。

黃芩苷（baicalin，批號110715-201117）、黃芩素（baicalein，批號111595-201105）、漢黃芩素（wogonin，批號111514-201016）、甘草苷（liquiritin，批號111610-201106）、甘草酸銨（ammonium glycyrrhizinate，批號110731-201116）、柴胡皂苷A（saikosaponin A，批號110777-201108）對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；漢黃芩苷（wogonoside，批號111014）對照品購于四川省維克奇生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純（美國Fisher），磷酸為分析純（天津市光復科技發(fā)展有限公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫，程序見表3，流速0.8 mL·min1；檢測波長210 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。所有組分于120 min內(nèi)被檢測完。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別取甘草苷、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、甘草酸銨、柴胡皂苷A和漢黃芩素對照品適量精密稱定，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.015 3，0.507，0.104，0.021 5，0.050 6，0.011 8，0.011 5 g·L-1的混合對照溶液，過0.45 μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液作為混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取同一廠家同一批次小柴胡顆粒適量，研成細粉，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取S1廠家小柴胡顆粒樣品1份，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別準確吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，按2.1項下條件測定，記錄指紋圖譜，以黃芩苷色譜峰（指紋圖譜中14號峰）為內(nèi)參比峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積比值，結(jié)果表明所有共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取S1廠家小柴胡顆粒樣品1份，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別在0，3，12，24，48 h，按2.1項下條件進樣測定，記錄指紋圖譜，以黃芩苷色譜峰（指紋圖譜中14號峰）為內(nèi)參比峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明所有共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗 取S1廠家小柴胡顆粒樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，各吸取10 μL，按2.1項下條件測定，記錄指紋圖譜，以黃芩苷色譜峰（指紋圖譜中14號峰）為內(nèi)參比峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明所有共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%，表明重復性良好。

2.5 小柴胡顆粒指紋圖譜的測定及技術參數(shù)

2.5.1 不同廠家小柴胡顆粒的指紋圖譜測定及共有峰標定 取上述11個廠家小柴胡顆粒樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別準確吸取混合對照品溶液及11個小柴胡顆粒樣品的供試品溶液各10 μL，按2.1項下條件測定，記錄指紋圖譜。

將圖譜數(shù)據(jù)導入指紋圖譜相似性評價軟件分析，以S2廠家小柴胡顆粒圖譜為參照圖譜，進行多點校正，匹配色譜峰，以中位數(shù)法生成對照圖譜，結(jié)果見圖1～3。

經(jīng)與對照品鑒定，21.065，49.573，90.143，98.369，102.766，104.913，110.005 min出峰分別為甘草苷（8號峰）、黃芩苷（14號峰）、漢黃芩苷（19號峰）、黃芩素（22號峰）、甘草酸銨（25號峰）、柴胡皂苷A（26號峰）、漢黃芩素（27號峰）。其中，黃芩苷（14號峰）分離度較好，峰面積較大且穩(wěn)定，故選其為參照峰（S）。以黃芩苷為參照峰的HPLC指紋圖譜確定共有峰29個，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積值，結(jié)果表明，11批不同生產(chǎn)廠家小柴胡顆粒相對保留時間的RSD較?。?～0.78%），而相對峰面積的RSD較大，說明小柴胡顆粒指紋圖譜中主要峰群的直觀特征基本一致，但各成分含量有較大的區(qū)別。

2.5.2 同廠家不同批次小柴胡顆粒的指紋圖譜測定 取上述S3和S11廠家各5個批次小柴胡顆粒樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，并按2.1項下條件測定，記錄指紋圖譜，見圖4，5。

2.5.3 相似度評價 采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A版）》評價2個廠家不同批次小柴胡顆粒的指紋圖譜，分別以S2，批號111249，110903圖譜為參照譜，以中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，計算樣品與共有模式之間的相似度，評價樣品質(zhì)量，見表4，5。

2.5.4 樣品色譜數(shù)據(jù)的系統(tǒng)聚類分析 運用SPSS軟件，對所得高效液相指紋圖譜數(shù)據(jù)進行聚類分析。采用組件均連法（average linkage between groups），利用夾角余弦（cosine）作為樣品的測度，聚類分析將不同廠家樣品分為3類。其中廠家S3，S4，S11分在第I類，廠家S1，S2，S5，S6，S7，S8，S9分在第II類，S10分在第III類，見圖6。由結(jié)果可知，不同廠家的小柴胡顆粒樣品存在不同程度的質(zhì)量差異。

3 討論

由于黨參、姜半夏、大棗和生姜4味藥材在該提取方法和色譜檢測條件下很難被檢測出來，所以在小柴胡顆粒指紋圖譜上沒有體現(xiàn)這幾個藥材的相關信息。

不同廠家和同一廠家不同批次的小柴胡顆粒樣品指紋圖譜相似度均大于0.9，表明各樣品相似度較好。不同廠家樣品之間相對含量RSD有差異，甚至某些組分差異較大，可能是由于不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)工藝參數(shù)、生產(chǎn)設備性能、對中藥材有效成分提取率的差異，造成了產(chǎn)品成分含量的差別，但各廠家樣品的指紋圖譜整體面貌相似，所建立的指紋圖譜相對保留時間重復性良好，相似度較高，可以作為鑒別小柴胡顆粒質(zhì)量的指標之一。

聚類分析結(jié)果顯示，不同廠家被聚為3類，說明廠家間質(zhì)量有所差異，原因可能是相似度的計算是按各色譜峰的峰面積中位數(shù)生成共有模式，其分析的是每張指紋圖譜的各個色譜峰；而聚類分析的計算是利用組件均連法，采用夾角余弦測定的，其分析的是各個指紋圖譜的共有峰，所以2種分析結(jié)果有所區(qū)別，但相似度結(jié)果中S10樣品相似度相對較低，在聚類分析結(jié)果中被單獨聚為第III類，說明2種分析結(jié)果大體相一致。

[參考文獻]

[1] 中國藥典. 一部[S]. 2010：509.

[2] 謝樂.小柴胡湯的藥理研究及該方在發(fā)熱性疾病中的應用[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生， 2007， 23（19）： 2930.

[3] 姜雪，李佳. 小柴胡湯的臨床應用與藥理研究[J]. 長春中醫(yī)學院學報， 2006， 22（1）： 81.

[4] 王曉軍，張春玲. 指紋圖譜技術在中藥質(zhì)量控制中的應用[J]. 甘肅中醫(yī)學院學報， 2004， 21（3）： 44.

Study on fingerprint of Xiaochaihu granules sold in the market

YAN Lei， LIN Long-fei， ZHANG Hui， DANG Xiao-fang， NI Jian*

（School of Chinese Material Medica， Beijing University of Traditional Chinese Medicine， Beijing 100102， China）