慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾NSD2三陰乳腺癌穩(wěn)定細(xì)胞株的建立
關(guān)鍵詞：nsd2 三陰乳腺癌 rna干擾 慢病毒
摘要：目的:構(gòu)建針對核受體結(jié)合SET結(jié)構(gòu)域蛋白2(nuclear receptor binding SET domain protein 2,NSD2)的短發(fā)夾干擾RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干擾載體,建立穩(wěn)定干擾NSD2基因的MDA-MB-231三陰乳腺癌細(xì)胞株。方法:構(gòu)建2條針對人源NSD2基因的shRNA(shNSD2-1#和shNSD2-2#),連接到慢病毒載體(pGLV10/U6/RFP/Puro)并進(jìn)行測序鑒定。將NSD2 shRNA慢病毒載體與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞,慢病毒包裝后進(jìn)行滴度檢測。將包裝好的慢病毒轉(zhuǎn)染至三陰乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中,嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NSD2 shRNA的細(xì)胞株。采用real-time PCR檢測NSD2 mRNA的表達(dá)變化,蛋白質(zhì)印跡法檢測NSD2及其特異性催化的組蛋白甲基化標(biāo)志物H3K36me2蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果:成功構(gòu)建兩個NSD2 shRNA慢病毒干擾載體;與陰性對照組相比,shNSD2-1#組和shNSD2-2#組MDA-MB-231細(xì)胞中NSD2 mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào),NSD2催化的H3K36me2蛋白表達(dá)也隨之下調(diào)。結(jié)論:本研究成功建立了shRNA慢病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定敲低NSD2的MDA-MB-231細(xì)胞株,證實干擾NSD2基因表達(dá)能有效抑制其對組蛋白H3K36的甲基化作用,為進(jìn)一步研究NSD2在乳腺癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
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