草魚肝細胞外泌體的分離鑒定及其對肝細胞miR-122/33和免疫相關(guān)基因表達的影響
關(guān)鍵詞：草魚 肝細胞 外泌體 分離 鑒定
摘要：外泌體是具有磷脂雙分子膜結(jié)構(gòu)的納米級囊泡,能夠參與機體多種生理過程。實驗探討了草魚肝細胞外泌體的分離鑒定方法,并初步研究外泌體對草魚肝細胞中miRNAs及免疫相關(guān)基因表達的影響。實驗以草魚肝細胞L8824為材料,通過超速離心獲得外泌體,利用電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài),采用納米顆粒示蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技術(shù)檢測外泌體粒徑和數(shù)量,同時利用Western blot分析其標志蛋白CD63的表達,最后用正常肝細胞和油酸誘導的脂肪肝細胞源外泌體孵育草魚肝細胞,通過Real-time qPCR技術(shù)檢測兩種不同來源的外泌體對草魚肝細胞中miR-122/33及免疫相關(guān)基因(TNF-α,NF-κB,IL-1β,IL-6和IL-10)轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示,草魚肝細胞外泌體為30~150 nm的不均勻囊泡,呈圓形或橢圓形,有完整的膜結(jié)構(gòu);外泌體標志蛋白CD63呈陽性表達;NTA技術(shù)檢測顯示外泌體囊泡占所有囊泡的50%以上;脂肪肝細胞源外泌體顯著提高了肝細胞中miR-122及炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。研究表明,通過超速離心法可成功分離草魚肝細胞外泌體,且脂肪肝細胞源外泌體在草魚肝細胞免疫調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮重要作用。
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