采用肝癌球體細(xì)胞篩選鑒定識別肝癌干細(xì)胞的單抗
關(guān)鍵詞：肝癌 腫瘤干細(xì)胞 單克隆抗體 cd90
摘要：目的采用肝癌球體細(xì)胞篩選鑒定識別肝癌干細(xì)胞的單抗,為靶向腫瘤干細(xì)胞治療肝癌提供候選治療單抗。方法采用無血清懸浮培養(yǎng)的方法富集培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞。通過細(xì)胞免疫熒光、順鉑耐藥實(shí)驗(yàn)、Real-timePCR、裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)等方法篩選、鑒定抗肝癌干細(xì)胞單抗。采用免疫組織化學(xué)的方法鑒定單抗識別的抗原在肝癌組織中的表達(dá)情況。質(zhì)譜鑒定抗原。結(jié)果MHCC97L細(xì)胞能在無血清懸浮培養(yǎng)條件下形成細(xì)胞球,并能被PKH26染料標(biāo)記。流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)MHCC97L球體細(xì)胞中CD90表達(dá)比例較親本細(xì)胞提高了3.4倍。無血清成球抑制實(shí)驗(yàn)獲得6株顯著抑制MHCC97L細(xì)胞在無血清成球的單抗,抑制率分別為54.67%,50.33%,45.73%,42.26%,39.11%,37.63%。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示單抗28C10和CD90在MHCC97L細(xì)胞中能共定位。Real-TimePCR檢測結(jié)果顯示MHCC97L28C10^+細(xì)胞Sox-2和Oct-4表達(dá)顯著高于MHCC97L28C10-細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測,在MHCC97L及其sphere細(xì)胞中28C10^+細(xì)胞比例分別為7.98%和10.7%,28C10^+細(xì)胞比例提高了1.34倍。流式細(xì)胞術(shù)分選獲得的28C10^+細(xì)胞的體外成球能力、侵襲能力顯著高于28C10-細(xì)胞。CCK-8法檢測結(jié)果顯示28C10^+細(xì)胞較28C10-細(xì)胞顯示出對化療藥物順鉑的耐藥,IC50分別為1.96μg/mL和1.16μg/mL。裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,28C10^+細(xì)胞裸鼠皮下接種2×10^4cells/只,2個月可形成腫瘤,成瘤率為40%。另外1只未形成腫瘤的裸鼠形成了肺部轉(zhuǎn)移灶(1/5)。免疫組化檢測顯示單抗28C10的靶抗原陽性率為72.0%(77/107),而在癌旁組織中低表達(dá),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。質(zhì)譜結(jié)果顯示28C10識別的抗原為HSP90α。結(jié)論采用MHCC97L球體細(xì)胞模型成功鑒定一株特異識別肝癌干細(xì)胞的單抗,為靶向肝癌干細(xì)胞的抗體治療奠定基礎(chǔ)。
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